كلون، بيان و تخليص پروتيين P647-153هموفيلوس آنفلوانزا

Cloning, Expression and Purification of P647-153 of Haemophilus influenzae

زمينه و هدف: همـوفيلوس آنفلوانزا، باسيل گرم منفي است كه بخشي از ميكروفلور نازوفارنكس را در اغلب افراد تشكيل داده و سويه هاي مختلف آن در دو گروه كپسولدار (قابل طبقه بندي) و بدون كپسول (غيرقابل طبقه بندي) مورد مطالعه قرار مي گيرد. پروتيين غشا خارجي P6، نوعي ايمونوژن حفاظت شده و پايدار درميان سويه هاي فاقد كپسول و نيز سويه‏هاي كپسولدار هموفيلوس آنفلوانزا مي باشد و خود بعنوان كانديد مناسبي جهت واكسيناسيون عليه هموفيلوس آنفلوانزا مطرح گرديده است. هدف از اين مطالعه، توليد و تخليص آنتي ژن نوتركيب P6 به عنوان يك پروتيين حامل در واكسنهاي كونژوگه مي باشد. روش كار: قطعه اي به طول324 جفت باز از بخش انتهاي ژن كد كننده پروتيين P6در حامل پلاسميدي pJET1.2 و متعاقبا در pET28a(+) كلون شد. القاي توليد پروتيين با يك ميلي مولار IPTG صورت گرفت و تخليص آن با حل كردن اجسام سلولي در اوره، جذب با رزين نيكل، حذف اوره با شيب كاهشي اوره در محلول هاي شستشو و نهايتا جمع آوري پروتيين نوتركيب به شكل محلول در ايميدازول انجام شد. حذف ايميدازول با دياليز در برابر بافرفسفات نمكي صورت پذيرفت. پروتيين نوتركيب P647-153 با استفاده از آنتي سرم پلي كلونال خرگوشي ضد هموفيلوس آنفلوانزا با استفاده از روش وسترن بلات تاييد گرديد. يافته ها: پروتيين نوتركيب P647-153در ميزبان DE3 ) E. coli BL21 ) با موفقيت بيان و تخليص گرديد (حدود 4 ميلي گرم درهر ليتر كشت مايع LB). ساختار آنتي ژني پروتيين نوتركيب P6 نيز با استفاده از ايمونوبلاتينگ تاييد شد. نتيجه گيري: نتايج وسترن بلات به موازات نتايج تعيين توالي، حاكي ازصحت توليد پروتيين P647-153 نوتركيب و حفظ نسبي ساختار اپيتوپي آن مي باشد.

Background & Objectives: Haemophilus influenzae is a Gram-negative bacterium that is part of the normal nasopharyngeal flora of most humans. H. influenzae strains were defined in two categories: encapsulated (typeable) and non-capsulated (nontypeable) strains. Outer membrane protein P6 is a highly conserved and stable protein in the outer membrane of both encapsulated and non-capsulated strains of H. influenzae. As an immunogen, P6 protein is a potential candidate vaccine against H. influenzae strains. The aim of this study was to produce recombinant protein P6 as a carrier protein for production of conjugate vaccines. Methods: The sequence (324 bp) coding P647-153 protein of H. influenzae was successfully cloned in pJET1.2 and subsequently in pET28a (+). Expression of the recombinant protein was induced with 1mM IPTG. Recombinant P647-153 was purified through dissolving inclusions in 8M urea buffer, absorbing to Ni-NTA resins, washing by buffers with decreasing urea concentration and finally eluted in Imidazole solution. Imidazole was removed by dialysis against PBS (pH 7.4). The recombinant p647-153 was confirmed by western blot analysis using rabbit anti H. influenzae polyclonal antiserum. Results: The recombinant P647-153 was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified (4 mg /lit of broth culture). The immunoblotting showed that recombinant P647-153 conserved its native antigenic structure. Conclusion: Western blot results, along with that of sequencing, confirmed accurate production of recombinant P647-153 and partially retention of its conformational epitopes.