شناسايي مورفولوژيك و مولكولي عامل بوته ميري خيار در رفسنجان*

IDENTIFICATION OF CUCUMBER DAMPING-OFF BASED ON MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATIONS IN RAFSANJAN

بيماري بوته ميري خيار از جمله عوامل محدود كننده كشت خيار كه باعث خسارت قابل توجهي در گلخانه‌هاي تجاري مي شود. به منظور شناسايي عوامل بيماري زا، نمونه‌برداري و جداسازي عامل بيماري طي سال‌هاي 1388 تا 1390 از گلخانه‌هاي تجاري خيار در رفسنجان انجام شد. تعداد 23 جدايه پيتيوم با استفاده از محيط كشت انتخابي جداسازي و بيماريزايي جدايه‌ها روي گياهچه‌هاي خيار ارزيابي و اثبات گرديد. شناسايي بيمارگر بر اساس ريخت شناسي پرگنه، ويژگي هاي ميكروسكوپي و روش مولكولي انجام شد. بر اساس ويژگي هاي ميكروسكوپي گونه P. aphanidermatum شناسايي گرديد. توالي نوكليوتيدي دي ان اي ناحيه ترانوبسي شونده داخلي ريبوزومي (rDNA-ITS) جدايه‌هاي انتخابي تعيين و به بانك ژن ارسال گرديد. جستجوي تشابه با GenBank-BLAST با استفاده از توالي ناحيه rDNA-ITS نشان داد كه P. aphanidermatum ثبت شده در بانك ژن با شماره ثبت AB355599 شبيه ترين توالي (بيش از99درصد تشابه) به جدايه به‌دست آمده مي باشد. شناسايي و رديابي مولكولي P. aphanidermatum از بافت آلوده بر اساس تكثير قطعه اختصاصي از ناحيه rDNA-ITS با استفاده از آغازگراختصاصي Paph54F/ITS2 انجام و اختصاصيت و حساسيت آغازگر بررسي شد. نتايج نشان داد كه جفت آغازگر مزبور براي رديابي بيمارگر P. aphanidermatum بسيار اختصاصي و قادر به تكثير قطعه 200 جفت بازي مي باشد. از طرفي قادر به رديابي كمتر از fg200 از DNA خالص بيمارگر در PCR معمولي مي‌باشد. استفاده از آغازگر طراحي شده زمينه رديابي P. aphanidermatum از بافت، آلوده را فراهم مي نمايد و هيچ باندي در تكثير با DNA به‌دست آمده از بافت خيار سالم ديده نمي‌شود.

Cucumber damping-off is a limiting factor in commercial greenhouse production. To determine the causal agents of disease, sampling and fungal isolation were performed during 2009 and 2011. A total of 23 isolates of Pythium sp. were obtained using selective media. Their pathogenicity was evaluated on cucumber seedlings under greenhouse conditions. All isolates were pathogenic. Morphological and molecular identifications of the isolates were performed. P. aphanidermatum was identified based on microscopic characteristics. The complete sequences of ribosomal DNA internal transcribed spacers regions of selected isolates were determined and submitted to GenBank. The GenBank-BLAST homology search revealed P. aphanidermatum as the most similar sequence ( > 99% identity) with GenBank entry AB355599. PCR primers were designed for the identification of P. aphanidermatum in which had a unique ITS sequence. The PCR primer combination Paph54F/ITS2 was species-specific with no cross-reaction to other Pythium species or to soil borne cucumber fungal pathogens tested. The detection limit was as little as 200 fg pure genomic DNA. P. aphanidermatum could be detected in lesions of infected cucumber stem tissue. No signals were obtained from healthy cucumber tissue DNA.