همسانه سازي و بيان ژن پروتيين ناقل ليپيد 2 برنج ايراني

Cloning and Expression of Lipid Transfer Protein-2 (LTP2) Gene from Iranian Rice

پروتيين هاي ناقل ليپيد (LTPs) گروهي از پروتيين ها با وزن ملكولي متوسط در نزد گياهان هستند كه داراي پتانسيل هاي كاربردي به ويژه در سيستم هاي رها سازي دارو مي باشند. هدف از اين تحقيق كلون كردن و بيان ناحيه كدكننده ژن LTP2 برنج در (TOP10) E.coli بود. از آنجاييكه ژن LTP2 برنج فاقد ابنترون مي باشد، ژنوم برنج جهت تكثير ناحيه كدكننده اين ژن استفاده شد. در انتهاي 5? پرايمر رفت جايگاه برش آنزيم BamHI و در انتهاي 5? پرايمر برگشت جايگاه برش آنزيم XhoI قرار داده شد. قطعه تكثير شده پس از تيمار با آنزيم هاي محدود كننده مذكور در جايگاه BamHI-XhoI وكتورpGEX-6p-2 و در پايين دست ژن GST جهت توليد پروتيين همجوش GST-LTP قرار گرفت. در مرحله بعدي وكتور نوتركيب به داخل باكتري (TOP10) E.coli ترانسفورم شد. براي اطمينان از صحت عمليات كلونينگ، پلاسميد هاي استخراج شده، در ناحيه LTP2 توالي يابي شدند. داده ها نشان داد كه توالي قطعه كلون شده مشابه توالي گزارش شده در NCBI است. همچنين يافته ها نشان داد كه موادي مثل بتايين، دي متيل سولفوكسيد (DMSO) و آمونيوم سولفات (AMS)مي توانند باعث افزايش محصولات اختصاصي PCR شوند. آناليز SDS-PAGE هم بيان LTP2 در باكتري را تاييد نمود.

Lipid Transfer Proteins (LTPs) are a family group of proteins with low average molecular weight in plants that have numerous potential applications especially in drug delivery systems. The aim of this research was to clone the LTP coding sequence in a prokaryotic expression vector to produce a fusion protein with GST in E.coli (TOP10). As there is no intron segment in rice LTP2 gene, specific primers were implemented to introduce BamHI and XhoI restriction sites at the head and tail of amplified LTP2 coding sequence respectively, using extracted rice genome as a template. After treatment by respected restriction endonucleases, the amplified fragment was inserted into the BamHI-XhoI sites in pGEX-6p-2 vector downstream of GST to make a chimeric DNA for further production of GST-LTP fusion protein. At the next step, the recombinant vector was transformed into TOP10 E.coli cells for amplifying purposes. To ensure the accuracy of gene cloning, extracted recombinant vector was sent for sequencing the inserted fragment. Data revealed that cloned fragment was bona fide sequence of rice LTP2 as was reported to NCBI. Results showed that PCR amplification of GC-rich DNA sequences could be improved by Betaine, DMSO and AMS. Finally, the expression of LTP2 in E.coli was confirmed by SDS-PAGE technique.