توليد روتاويروس گاوي بازآرايي شده از طريق تكثير آن با نسبت بالاي عفونت‏زايي ويروس به سلول در كشت سلول و تكثير ژن‏هاي غير ساختماني با روش RT-PCR

Rearranged Bovine Rotavirus Production through Cultivation of Virus by High Multiplicity of Infection (MOI) in Cell Culture and Amplification of Non-structural Genes using RT-PCR

هدف: گروه A روتاويروس، مهم‏ترين عامل ويروسي گاستروانتريت و اسهال شديد در نوزادن و كودكان و مسيول حدود 600 تا 870 هزار مرگ در سال است، بنابراين تشخيص و درمان اين بيماري از اهميت ويژه‏اي برخوردار است. بازآرايي ژن‏ها طي پاساژهاي متوالي ويروس با نسبت بالاي عفونت‏زايي در كشت سلول و همچنين در عفونت‏هاي مزمن در بيماران با نقص ايمني تشخيص داده شده است. در اين مطالعه روش RT-PCR براي رديابي، تشخيص و تكثير ژن‏هاي روتاويروس استاندارد و بازآرايي شده راه‏اندازي شده است. مواد و روش‏ها: RNA روتاويروس از رده سلولي MA-104 آلوده استخراج شد و حضور ژنوم توسط الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد 10 درصد و رنگ‏آميزي نيترات نقره، مشخص شد. تكثير توالي كامل ژن‏هاي كد كننده NSP1, 2, 3، با واكنش RT-PCR، براي روتاويروس استاندارد و بازآرايي شده، با آغازگرهاي اختصاصي انجام گرفت. نتايج: بازآرايي در ژن‏هاي NSP1, 3 با تغيير الگوي مهاجرت اين قطعات در ژل، توسط الكتروفورز در ژل پلي آكريل آميد نشان داده شد. طول كامل محصولات ژن‏هاي كد كننده NSP1, 2, 3 براي روتاويروس استاندارد و بازآرايي شده تكثير شد و براي تعيين توالي ارسال شد. نتايج، شكل‏گيري قطعات ژنومي بازآرايي شده، طي پاساژ متوالي روتاويروس گاوي سويه RF را نشان داد. نتيجه‏گيري: تكثير متوالي ويروس با نسبت بالاي عفونت‏زايي در كشت سلول و همچنين عفونت‏هاي مزمن در گروه‏هاي هدف با نقص ايمني در تكامل آن نقش دارد و از طرف ديگرروش‏هاي استفاده شده براي تعيين ويژگي به طور مداوم در حال تحول و تعريف مجدد است. با در نظر گرفتن تحقق موفقيت مطالعات روتاويروس و اهميت زياد توسعه واكسن‏هاي روتاويروسي، مطالعه بيشتر جزييات بازآرايي و جمع‏آوري داده براي فهم بهتر ويژگي‏هاي آنتي‏ژنيك و مولكولي ويروس لازم است. مطالعه حاضر اهميت تنوع ژنتيكي را نشان داده و مي‏تواند اطلاعات ارزشمندي در زمينه تكثير، تنوع، زيست‏شناسي و تكامل روتاويروس را فراهم نمايد.

Objective: Group A rotaviruses (GARV) are responsible for the vast majority of severe diarrhea worldwide that kills an estimated 600,000-870,000 children annually. Since infantile gastroenteritis is a main health problem, therefore diagnosis and treatment of this disease is crucial. Gene rearrangements have been detected in vitro during serial passages of the virus at a high multiplicity of infection (MOI) in cell culture, as well as in chronically infected immunodeficient individuals. In this study, we developed an RT-PCR method to detect and diagnose the standard and gene rearranged bovine rotavirus. Methods: Rotavirus RNA was extracted from confluent monolayers of infected MA-104 cells, stained with silver nitrate, and then electrophoresed in a 10% polyacrylamide gel. The full-length gene products that encoded the NSP1, 2, and 3 genes of the standard and rearranged rotavirus were amplified by RT-PCR using specific primers. Results: We observed rearranged NSP1 and NSP3 genes that had different migration patterns seen with polyacrylamide gel electrophoresis. NSP1, 2, and 3 gene segments from standard and rearranged rotaviruses were amplified by RT-PCR, then the complete nucleotide sequence of each gene was subjected to sequencing. The results showed the generation of gene rearrangement through serial passages of the bovine rotavirus RF strain. Conclusion: Serial passage of rotavirus in cell culture at a high MOI and chronic infection in immunodeficient target groups might alter rotavirus evolution. The methods utilized for detection and characterization of rotaviruses are continually evolving and being refined. Data collection is necessary to understand the molecular and antigenic features of the rotavirus in order to have a successful implementation of rotavirus studies and the development of a rotavirus vaccine. This study shows the importance of genetic variation and can provide valuable information about the amplification, diversity, biology, and evolution of rotaviruses.