جداسازي، تكثير و غني‏سازي سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني موش نوزاد در روش هم‏كشتي با سلول‏هاي سرتولي اتولوگ

Isolation, Expansion and Purification of Mouse Spermatogonial Stem Cells in an Autologous Sertoli Cell Co-culture System

هدف: ارايه يك روش ساده براي جداسازي، تكثير و غني‏سازي سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني موش نوزاد مواد و روش‏ها: سوسپانسيون سلولي حاوي سلول‏هاي اسپرماتوگوني و سرتولي با استفاده از هضم آنزيمي از بيضه موش نوزاد دو روزه جداسازي شد. سلول‏ها به صورت هم‏كشتي و در محيط كشت DMEM/F12 حاوي 10 درصد سرم به مدت دو هفته كشت داده شدند. ماهيت سلول‏هاي سرتولي و اسپرماتوگوني به ترتيب توسط بيان پروتيين‏هاي ويمنتين وPLZF تاييد شد. براي ارزيابي ميزان تكثير سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني تعداد كلوني‏هاي تشكيل شده و مساحت آن‏ها در طول دو هفته كشت اندازه‏گيري شد. در پايان هفته دوم، بيان ژن‏هاي اختصاصي سلول‏هاي اسپرماتوگوني (Stra8، Piwill2، DAZL، Mvh) ارزيابي شد. نتايج: نتايج به‏دست آمده نشان داد كه سلول‏هاي اسپرماتوگوني و سرتولي جدا شده نشانگرهاي اختصاصي اين سلول‏ها را بيان مي‏كنند. در طي دوره كشت، بين چهار نقطه زماني اختلاف معني‏داري در تعداد و مساحت كلوني‏هاي سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني ديده شد (05/0P < ). علاوه بر اين بيان ژن‏هاي اختصاصي سلول‏هاي اسپرماتوگوني بعد از دو هفته كشت، نشان دهنده عدم تمايز اين سلول‏ها بود. نتيجه‏گيري: مطالعه حاضر نشان داد كه هم‏كشتي سلول‏هاي اسپرماتوگوني و سلول‏هاي سرتولي با منبع يكسان محيط رشد مناسب و بهينه‏اي را فراهم مي‏كند كه بدون اضافه كردن عوامل رشد خارجي و دستكاري‏هاي شيميايي مي‏توان از آن براي تكثير سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني استفاده كرد.

Objective: This study presents a simple method for isolation, expansion and purification of neonatal mouse spermatogonial stem cells. Methods: We used enzymatic digestion to isolate a cell suspension of spermatogonia and Sertoli cells from neonatal 2-day-old mice. The cells were cultured in DMEM/F12 that contained 10% serum for two weeks. Sertoli and spermatogonia cell characteristics were confirmed by examining for the presence of vimentin and PLZF proteins, respectively. To assess the rate of spermatogonia stem cell expansion, the area and number of colonies were measured during the two weeks of culture. At the end of the second week, we detected spermatogonia cell-specific expressions of the Stra8, Piwill2, DAZL, and Mvh genes. Results: Current results indicated that isolated Sertoli and spermatogonia cells were immunopositive for specific markers. During the culture period, a significant difference was seen in the number and area of spermatogonial stem cell colonies (P < 0.05) at four time points. In addition, spermatogonial specific gene expression demonstrated that these cells were undifferentiated after two weeks of culture. Conclusion: Our study showed that co-culture of spermatogonia and Sertoli cells from same source provides a convenient and efficient environment. This co-culture, without the addition of external growth factors and chemical manipulations, can be used for proliferation of spermatogonia stem cells.