طراحي، ساخت و ارزيابي بيان پلاسميد نوتركيب pIRES-Igk/mIL18/Fc با هدف استفاده در مطالعات واكسن

Designing and construction of bicistronic plasmid pIRES-Igk/mIL18/Fc: potential implications for vaccine investigations

هدف: اينترلوكين 18 سايتوكايني است كه نقش مهمي در پاسخ سلول‏هاي T كمكي نوع يك بازي مي‏كند و بنابراين پلاسميد بيان كننده آن، به‏عنوان يك ادجوانت قوي ژنتيكي در زمينه مطالعه واكسن‏هاي DNA به‏شمار مي‏رود. در اين مطالعه پلاسميد جفت بياني كد كننده اينترلوكين 18، ترشحي (و به‏صورت متصل با قسمتي از FC?2a) ساخته شد و بيان اين سايتوكين نوتركيب ارزيابي شد. مواد و روش‏ها: RNA از سلول‏هاي تحريك شده طحال موش استخراج و با استفاده از RT-PCR قطعات cDNA متعلق به اينترلوكين 18 موشي (mIL-18) و بخشي از توالي FC?2a ساخته شد. در ادامه به منظور ساخت قطعه mIL-18/Fc ابتدا قطعات FC و اينترلوكين 18 موشي در پلاسميد pSL1180 وارد شده و سپس اين قطعه در پلاسميد pSectag2a به منظور اضافه شدن توالي نشانه كاپاي ايمنوگلبولين (Igk) كلون شد. در نهايت Igk/mIL-18/Fc درميان سايت آنزيمي NheI/XmaI، پايين دست ناحيه پروموتوري سيتومگالوويروس، در ناقل pIRES2-EGFP كلون و پلاسميد pIRES-Igk/mIL-18/Fc ساخته شد. سپس اين پلاسميد در رده سلولي HEK293T به‏وسيله محلول ترانسفكشن توربوفكت ترانسفكت شده و بيان آن با روش الايزا ارزيابي شد. نتايج: بررسي هضم آنزيمي پلاسميدهاي pSL-mIL-18، pSL-mIL-18/Fc، pSec-mIL-18/Fc و pIRES-Igk/mIL-18/F، با استفاده از آنزيم‏هاي اختصاصي مورد استفاده در كلونينگ، منجر به جداسازي قطعات مورد انتظار شد و سپس درستي ترادف و قالب بيان پلاسميد pIRES-Igk/mIL-18/F با روش توالي‏يابي تاييد شد. علاوه بر اين بيان و ترشح سايتوكين نوتركيب در محلول رويي سلول‏هاي ترانسفكت شده HEK293T در مقايسه با كنترل ترانسفكت تاييد شد. نتيجه‏گيري: در حالي‏كه پلاسميد pIRES-Igk/mIL-18/Fc قابليت كلونينگ و بيان آنتي‏ژن مد نظر را داشته، همچنين قابليت بيان پروتيين اينترلوكين 18 را به‏عنوان يك ادجوانت قوي ژنتيكي را به‏همراه دارد. اين نتايج در طراحي يك واكسن DNA كارا به‏منظور ارتقاي پاسخ ايمني سلولي مفيد بوده و علاوه بر اين هدفي جديد در راستاي دستيابي به نسل جديد از واكسن DNA به‏حساب مي‏آيد.

Objective: IL18 is a cytokine that plays an important role in the T-cell-helper type 1 (Th1) response and hence, plasmid-encoded IL18 is considered as a potent genetic adjuvant for DNA vaccine studies. In this study, a bicistronic eukaryotic plasmid capable of secreting a more stable mouse IL18 (fused with Fc?2a fragment) was constructed and expression of this chimer cytokine was also assessed. Materials and Methods: RNA purified from stimulated mouse spleenocytes and then cDNA corresponding to mouse IL18 (mIL18) and Fc?2a fragments were constructed by RT-PCR. Sequential subcloning of mIL18 and IgG2aFc fragments first into pSL1180 and then pSecTag2 plasmids resulted in the fusion of mIL18/Fc and addition of immunoglobulin kappa signal sequence (Igk/mIL18/Fc), respectively. Final cloning of Igk/mIL18/Fc sequence downstream of CMV promoter into the NheI/XmaI sites of pIRES2-GFP plasmid and led to the construction of pIRES-Igk/mIL18/Fc plasmid, which was transfected to HEK293T cell line by Turbofec Transfection reagent and expression analysis, was evaluated by ELISA assay. Results: Restriction enzyme analysis of pSL-mIL18، pSL-mIL18/Fc، pSec-mIL18/Fc and pIRES- Igk/mIL18/Fc plasmids with the enzymes that were applied for clonings led to the isolation of fragments with expected size and then plasmid of pIRES- Igk/mIL18/Fc was also confirmed following sequencing reactions. Moreover, expression and secretion of mIL18 to the medium was evidenced in transfected 293T cells, compared to non-transfected controls. Conclusion: pIRES- Igk/mIL18/Fc plasmid possesses the capacity of the cloning and expression of putative antigen gene under the direction of IRES sequence, and also expression of mIL18 as a great secretive genetic adjuvant. This results can be useful to design an efficient DNA vaccine especially for inducing host cellular immune response, moreover, cab be considered a promising for accessing to new generation of DNA vaccine.