ساخت نانوحامل دندريمري پلي آميدوآمين-پلي اتيلن گليكول هدف گيرنده TAG72 براي انتقال ژن t-Bid به سلول‏هاي توموري كولوركتال

Construction of PEG-PAMAM dendrimer-based TAG72-targeting nanocarrier for t-Bid gene delivery to colorectal tumor cells

هدف: هدف از اين تحقيق ساخت و بررسي اثر نانوحامل‏هاي پلي آميدوآمين- پلي اتيلن گليكول هدفمند شده با نانوبادي عليه TAG72 براي انتقال سازه كد كننده ژن t-Bid به سلول‏هاي آدنوكارسينوماي كولون انساني است. مواد و روش‏ها: ساب‏كلونينگ ژن نانوبادي در ناقل بياني pSJ براي توليد انبوه پروتيين نانوبادي انجام و سپس نانوبادي با كاربرد ستون نيكل جداسازي شد. فرآيند جداسازي با SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ تاييد شد. افزودن پلي اتيلن گليكول به نانوذرات پلي آميدوآمين با نسبت مولي 1 به 2 (پلي آميدوآمين به پلي اتيلن گليكول) و هدفمندسازي با نانوبادي عليه TAG72 با نسبت مولي 1 به 1 انجام شد. بار سطحي و اندازه نانوذرات به‏ترتيب با دستگاه زتا سايزر مالورن و نانوسايت بررسي و كارايي حامل ژني ساخته شده در انتقال ژن كشنده t-Bid به سلول‏هاي آدنوكارسينوماي كولون در محيط آزمايشگاه با آزمون‏هاي Real Time PCR و تعيين ميزان مرگ و مير سلولي بررسي شد. نتايج: نتايج بررسي با نانوسايت و زتا سايزر مالورن، به‏ترتيب ساخت نانوذرات هدفمند با اندازه 92±162 نانومتر و پتانسيل سطحي 57/4+ را نشان مي‏دهد. آزمون تاخير حركت در ژل، كارآيي حامل ساخته شده را براي دربرگيري و فشرده‏سازي سازه ژني تاييد مي‏كند. نتايج Real Time PCR افزايش بيان ژن هدف در سلول‏هاي توموري را تاييد مي‏كند. نتيجه‏گيري: نتايج اين مطالعه كارآيي دندريمرهاي پلي آميدوآمين در انتقال ژن و نيز تاثير مثبت افزودن پلي اتيلن گليكول و اتصال نانوبادي عليه TAG72 به اين نانوحامل ژني (براي هدفمندسازي انتقال ژن به سلول) را تاييد مي‏كند.

Objective: The objective of this study is to develop and assess targeted PAMAM-PEG nanocarrier with anti-TAG72 nanobody for t-Bid gene coding construct delivery into the human colonic adenocarcinoma cells. Materials and Methods: Nanobody (Nb) coding sequence was subcloned into pSJ expression vector for large-scale production and then Nb was purified by Ni++ affinity chromatography. SDS-PAGE and western blot analysis were performed to verify purifiction. PAMAM was reacted with PEG at the ratio 1:2 (mol/mol) and anti-TAG72 Nb at the ratio 1:1 (mol/mol). Surface charge and size of resulting nanoparticles were evaluated by Malvern zeta sizer and Nanosight. Efficiency of constructed gene carrier for t-Bid, a killer gene, delivery into colonic adenocarcinoma cells in in vitro was assessed using real time PCR and cell counting assays. Results: Production of nanoparticles with the average size of 162±92 nm and +4.57±0.52 zeta potential was confirmed by nanosight and Malvern zeta sizer in order. Gel retardation assay result verified efficiency of carrier for pDNA comlexation. Real time PCR results confirmed the target gene overexpression in the cancerous cell lines. Conclusion: The results of this research confirms the efficiency of PAMAM dendrimers for gene transferring, positive effect of PEGylation and targeting of nanoparticles by anti-TAG72 nanobody.