كلونينگ شكل جديدي از فعال كننده پلاسمينوژن انساني نوتركيب در سيستم يوكاريوتيك

Cloning of new form of human tissue plasminogen activator (K2S) in eukaryotic system

پروتيين فعال كننده پلاسمينو‍‍ژن ( tPA) به عنوان عامل ترومبوليتيك برتر جهت درمان بيماريهايي نظير انفاركتوس ميوكارد حاد شناخته شده و امروزه بهبود ويژگيهاي فارماكوكينتيك آن مورد توجه قرار گرفته است. Reteplase(K2S) مشتقي از مولكول tPA مي باشد كه نيمه عمر و مقاومت آن به مهاركننده نسبت به مولكول tPA طبيعي افزايش چشمگيري را نشان مي دهد. در اين تحقيق هدف اصلي كلونينگ و بيان فرم K2S ژن tPA در سيستم يوكاريوتيك Leishmania tarentolae مي باشد كه جديداً به عنوان ميزبان مناسب جهت كلونينگ و بيان ژنهاي يوكاريوتيك معرفي شده است. كاست بياني واجد فرم K2S از پروتيين tPA همراه با توالي signal sequence حاصل از اسيد فسفاتاز ترشحي ليشمانيا و دو قطعه از لوكوس زيرواحد كوچك ريبوزومي rRNA كه در نوتركيبي همولوگ مورد نياز است طي پروسه الكتروپوريشن به داخل سلولهاي L. tarentolae وارد گرديد. تست PCR تشخيصي ادغام كاست بياني K2S در سايت 18srRNA را نشان داد. تست زيموگرافي روي سوپرناتانت كشت سلولهاي ترانسفكت L .tarentolae نشان داد كه اين سلولها قادر به توليد پروتيين نوتركيب K2S به صورت خارج‌سلولي با فعاليت سرين پروتيازي مناسب خود مي باشند و بنابراين مشخص شد كه پروتيين rK2S توليد شده در سلولهاي L .tarentolae از لحاظ بيولوژيكي فعال بوده و در اين سيستم فولدينگ مناسب خود را يافته اند. با توجه به اين كه محيطهاي كشت اين سيستم بياني يوكاريوتيك ساده و ارزان قيمت مي باشد و همچنين نتايج اين تحقيق نشان داد كه L .tarentolae مي تواند به عنوان يك سيستم مناسب جهت توليد rK2S مورد استفاده قرار گيرد، لذا مي توان اميد داشت كه با توليد و بهينه سازي بيان rK2S در اين سيستم بتوان هزينه توليد اين دارو را به حداقل رساند.

Tissue plasminogen activator (tPA) protein was found as superior therombolytic agent for treatment of diseases such as acute myocardial infarction and efforts is currently focused to improve the tPA molecule and thereby itʹs pharmacokinetic properties. Reteplase (K2S) is a derivative tPA that has a longer half-life and greater resistance to inhibitor than the natural tPA molecule. The aim of this research is cloning and expression of K2S form of the tPA cDNA in eukaryotic system L. tarentolae which is recently has been introduced as a suitable host for expression eukaryotic genes. K2S form of tPA cDNA amplified by PCR and has cloned at ssurRNA (18s) site of L. tarentolae genome by homologous recombination. Diagnostic PCR analysis showed integration of K2S expression cassette in 18srRNA gene. Performance of zymography analysis on culture supernatant of transfected L. tarentolae showed serine protease activity of the rK2S protein produced and demonstrate that rK2S protein produced in L. tarentolae cells was biologically active. Hence, L. tarentolae is the first useful biotechnologically eukaryotic organism and simple nutrient requirements; we hope to reduce the production cost of this protein by cloning of K2S gene in this system.