طراحي روشي جديد مبتني‌بر ARMS PCR براي تشخيص ژنوتيپ پلي‌مورفيسم C/T 1562- در پروموتور ژن MMP-9

Design of a New Method of ARMS PCR for Detection of MMP-9 Promoter -1562 C/T Polymorphism

مقدمه: كلاژناز نوع-4 (MMP-9) يكي از مهم‌ترين ژن‌هايي است كه به‌علت هضم كلاژن مي‌تواند در جدايي سلول‌ها از بافت پايه و بدخيمي آنها نقش داشته باشد و به همين علت به‌عنوان يك تومور ماركر براي چنيدن سرطان مهم معرفي شده است. وجود پلي‌مرفيسم تك‌نكليوتيدي T/C در ناحيه 1562- پروموتوري اين ژن، باعث افزايش بيان اين ژن در سطح رونويسي ازطريق كاهش اتصال پروتيين‌هاي مهار‌كننده رونويسي در افراد واجد آلل T مي‌گردد. با‌توجه‌ به اهميت اين پلي‌مورفيسم، هدف تحقيق حاضر طراحي روشي براي تعيين ژنوتيپ افراد در اين پلي‌مورفيسم، بدون استفاده از PCR-RFLP است. مواد و روش‌ها: با استفاده از سايت اطلاعات ژني EPD توالي دو طرف منطقه موردنظر دريافت و نرم‌افزار PRIMER1 جهت طراحي چهار جفت پرايمر اختصاصي آلل براي دو طرف منطقه موردنظر استفاده شد. با انجام PCR‌هاي مختلف، دو جفت پرايمر بهتر انتخاب و PCR ARMS براي آنها بهينه‌سازي شد. براي تاييد نتايج PCR از تعيين توالي (Sequencing) استفاده شد. نتايج: با استفاده از پرايمرهاي طراحي‌شده، محصول PCR داراي طول 205 نوكليوتيد، نشانگر وجود آلل C و محصول داراي طول 253 نوكليوتيد، نشانگر وجود آلل T بود. نتيجه‌گيري: با استفاده از اين تكنيك بدون نياز به هضم آنزيمي RFLP و با سرعت و دقت بالا مي‌توان ژنوتيپ افراد را با يك PCR اختصاصي ARMS مشخص كرد.

Introduction: Type IV collagens is one of the most important genes which due to its function in collagen digestion can be affective in separation of the cells from the basal lamina and the metastasis of them so this gene is known as a tumor marker of several cancers. Existence of a single nucleotide polymorphism -1562 C/T at this gene’s promoter case leads to over expression of this gene in transcription level by decreasing inhibitor protein bonding on T alleles. The aim of the present study was to investigate a new method for the person’s genotype on this polymorphism without the use of PCR_RFLP. Methods: Using EPD genome database, the sequences of the intended region were received and by using PRIMER1 software 4 primers were designed for the area. With multiple PCR reaction, two pairs of the best primers were selected and the ARMS PCR was optimized for them. The PCR genotyping results were approved by direct Sequencing. Results: With the use of the newly designed primers, the ARMS PCR product with 205 nucleotide size showed C allele and the PCR products with 253 nucleotide sizes showed the T allele. Conclusions: With the use of this technique, we can determine the person’s genotype with an ARMS PCR without the use of RFLP and with a higher speed and accuracy.