بررسي ارتباط بين كمبود پروتامين و آزاد شدن قطعات DNA از اسپرم‌هاي نگهداري شده در محيط مصرفي Ham’s F10

Relationship between Protamine Deficiency and DNA Fragments Release from Sperm Incubated in Ham’s F10 Medium

زمينه و هدف: كمبود پروتامين و آسيب DNA بر ميزان بيان ژن‌ها در دوره‌ي جنيني اثر مهمي دارد. نگهداري اسپرم در محيط كشت موجب تغييرات مورفولوژيك هسته و آزاد شدن DNA مي‌گردد. با وجود اين، ارتباط بين كمبود پروتامين و ميزان آزاد سازي قطعات DNA از اسپرم‌ها‌ي نگهداري شده در محيط كشت و حضور ژن DNMT1 در اين قطعات مشخص نمي‌باشد. روش بررسي: آناليز مايع سيمن طبق معيار WHO انجام شد. جهت تعيين كمبود پروتامين از رنگ‌آميزي CMA3 استفاده گرديد. 20 ميليون اسپرم از هر نمونه در محيط مصرفي Ham’s F10 به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه‌ي سانتي‌گراد انكوبه شد. پس از سانتريفوژ كردن، از فاز سوپرناتانت استخراج DNA صورت گرفت. غلظت DNA توسط بيوفوتومتر تعيين گرديد. حضور ژن DNMT1 توسط انجام PCR با پرايمر‌هاي اختصاصي و الكتروفورز محصولات PCR بر روي ژل آگارز تاييد شد. يافته‌ها: بين ميزان قطعات DNA آزاد شده از اسپرم در محيط كشت و رنگ آميزي CMA3 ارتباط مستقيم و معني‌داري مشاهده گرديد (05/0P < ). بين ميزان قطعات DNA آزاد شده از اسپرم در محيط كشت و حضور ژن DNMT1 ارتباط مستقيم و معني‌داري وجود دارد (05/0P < ). ارتباط معني‌داري بين كمبود پروتامين و حضور ژن DNMT1 در قطعات آزاد شده از اسپرم مشاهده نشد. نتيجه گيري: مطالعه‌ي حاضر بيانگر اين امر است كه انكوباسيون اسپرم‌هاي داراي كمبود پروتامين منجر به آزاد شدن قطعات بيشتري از DNA اسپرم مي‌گردد كه در نهايت سلامت جنين‌هاي حاصل از اين اسپرم‌ها را تحت تاثير قرار مي‌دهد. واژگان كليدي: پروتامين، كروماتين اسپرم، قطعات DNA

Background and Objective: Protamine deficiency and DNA fragmentation have a profound effect on embryo gene expression. Incubation of sperm in culture medium leads to morphological changes of the nucleus and DNA release. However, the relationship between protamine deficiency and DNA fragments released from incubated sperm and the presence of the DNMT1 gene is not known. Materials and Methods: Semen analysis was performed according to the WHO criteria. CMA3 staining was used to determine protamine deficiency. Twenty million sperms per sample were incubated in Ham’s F10 medium for 24 hr at 37 °C. After centrifugation, DNA was extracted from the supernatant. DNA concentration was measured by biophotometer. The presence of the DNMT1 gene was confirmed by PCR using specific primers and agarose gel electrophoresis. Results: A significant correlation was observed between the DNA fragments released from sperm in culture media and CMA3 staining (P < 0.05). The presence of DNMT1 gene was significantly correlated with DNA fragments released from the sperm (P < 0.05). Protamine deficiency and the presence of DNMT1 gene were not significantly correlated. Conclusion: These results demonstrate that incubation of protamines-deficient sperm leads to the release of additional DNA fragments that eventually could have detrimental effectson embryo’s health. Keywords: Protamine, Sperm chromatin, DNA fragments