تشخيص همزمان سه باكتري سالمونلا تيفي، باسيلوس آنتراسيس و يرسينيا پستيس با راه اندازي مولتي پلكس پي‌سي‌آر

Simultaneous Detection of Salmonella typhi, Bacillus antheracis, and Yersinea pestis by Multiplex PCR

زمينه و هدف: سه باكتري سالمونلا تيفي، باسيلوس آنتراسيس و يرسينيا پستيس از پاتوژن‌هاي واقعي براي انسان محسوب مي‌شوند و تشخيص به‌موقع و زود هنگام آن‌ها حايز اهميت بسياري است. سالمونلا تيفي باعث بيماري حصبه، باسيلوس آنتراسيس باعث سياه زخم و يرسينيا پستيس سبب بيماري طاعون مي‌شود. اين سه نوع باكتري به‌عنوان عوامل بيولوژيك نظامي نيز استفاده مي‌گردد. روش‌هاي كلاسيك تشخيص اين باكتري‌ها طولاني و پيچيده است. مطالعه‌ي حاضر ارايه‌ي يك روش تشخيصي مولكولي جديد و سريع براي تشخيص همزمان اين سه باكتري در يك واكنش مولتي پلكس پي‌‌سي‌‌آر مي‌باشد. روش بررسي: واكنش زنجيره ايي پلي مراز Polymerase Chain Reaction, PCR) ) برروي ژن‌هاي ويرولانس invA,hp سالمونلا تيفي،Pa,chr باسيلوس آنتراسيس و pla يرسينيا پستيس به صورت يوني پلكس و مولتي پلكس پي سي آر طراحي و انجام شد. DNAژنومي از ساير باكتري‌ها جهت بررسي ويژگي پرايمر و آزمايش PCR استفاده شد. جهت بررسي حساسيت واكنش از دو روش شمارش كلني و رقت ژنوم استفاده شد. يافته‌ها: بررسي اين روش با سويه‌هاي استاندارد مشخص نمود كه پرايمرها اختصاصي است و محصولات با اندازه‌ي مورد نظر توليد گرديد. بررسي حساسيت روش نشان داد كه اين روش قادر است 1 تا10 كپي ژنوم و يا 1 تا 10 واحد كلني براي هر كدام از اين باكتري‌ها به‌طور اختصاصي تشخيص دهد. براي تاييد محصولات ايجاد شده در PCR تمام قطعات به‌جز محصول bp1083 باسيل آنتراكس تعيين ترادف شدند و آنتراكس با پرايمر 125 برش آنزيمي تاييد گرديد. نتيجه‌گيري: براساس اين مطالعه روش طراحي شده ابزاري دقيق، سريع و كم هزينه براي جستجو و تشخيص اين باكتري‌ها از ساير باكتري‌هاي هم‌خانواده و تشخيص سريع اين سه عامل در نمونه‌هاي مختلف و جستجو و تشخيص اين باكتري‌ها را در موارد بيوتروريستي فراهم مي‌كند. واژگان كليدي: تشخيص، باسيلوس آنتراسيس، سالمونلا تيفي، يرسينيا پستيس، مولتي پلكس پي‌سي‌آر.

Background and Objectives: Salmonella typhi, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis are potent human pathogenic bacteria that cause typhoid fever, anthrax, and plague,respectively. The classic microbiological methods for detection and identification of these agents are laborious and time consuming.Therefore, developing an accurate method for rapid detection of these potent human pathogens is important, especially due to their potential use as Bioterrorism agents. We have designed a new rapid molecular detection method by using multiplex PCR in a single reaction. Materials and Methods: PCR was carried out using specific primers for the virulence factor of S. typhi, hp and invA, B. anthracis virulence factors, chr and pa, and Y. pestis toxin, pla. The primer sets were tested for cross reactivity with individual DNA strains and mixtures in a multiplex PCR format. For determination of sensitivity of the method, we used colony counting and genomic DNA dilution. Results: Theresult with standard strains revealed that primers are specific for each strain as they have successfully amplified the desire products. The sensitivity analysis showed a 1-10 CFU and 1-10 copies of the genomes. In this respect, the accuracy of the result was checked by sequencing of the 1083-bp PCR products, except for anthrax, which was determined by enzymatic digestion. Conclusion: We have found a rapid, specific, sensitive, and a non-expensive molecular method for detection of three potent human pathogens. This finding provide an efficient diagnostic tool to determine these bacteria in bioterrorism samples. Keywords: Detection, Salmonella typhi, Bacillus antheracis, Yersinia pestis, Multiplex PCR