استفاده از ژن بتايين‌آلدهيد دهيدروژناز به عنوان نشانگر غيرآنتي‌بيوتيكي و ايمن در طراحي حامل پلاستيدي

The Use of Betaine Aldehyde Dehydrogenase as a Non-Antibiotic and Safe Selective Marker in Designing of Plastid Vector

در بيشتر مطالعات مرتبط با انتقال ژن به گياهان، از ژن‌هاي مقاومت به آنتيبيوتيك براي بازيابي گياهان تراريخته استفاده مي‌شود، اما معرفي چنين محصولاتي به درون زنجيره غذايي ممكن است نگراني‌هايي را از لحاظ ايمني‌زيستي ايجاد نمايد. ژن بتايين‌آلدهيد دهيدروژناز (BADH) به عنوان يك نشانگر غيرآنتي‌بيوتيكي براي استفاده در حامل‌هاي پلاستيديِ طراحي‌شده در اين تحقيق در نظر گرفته شد. توالي ژن مذكور از منشا اسفناج از 6111 جفت باز با دربرداشتن چهارده اينترون، به 1494 جفت‌باز پس از حذف اينترون‌ها كاهش يافت و سپس بر اساس كدون‌هاي رايج ژنوم پلاستيدي بهينه‌سازي كدوني شده و نيز با تغيير توالي نوكليوتيدي بدون تغيير در اسيدآمينه، هشت جايگاه‌هاي آنزيمي داخلي ناحيه كدكننده اين ژن حذف گرديد. افزايش درصد آدنين-تيمين نيز در اين بهينه‌سازي كدوني مورد توجه قرار گرفت. توالي نهايي ژن BADH به ناحيه بدون ترجمه ‘5 مربوط به T7gene10 فاژي متصل گرديد و با استفاده از SOEing PCR تحت پيشبر قوي كلروپلاستي Prrn قرار داده شد. بين پيشبر و ژن BADH محلي براي اتصال به ريبوزوم تعبيه و جايگاه‌هاي آنزيمي براي كلون‌سازي ژن‌هاي دلخواه ديگر در نظر گرفته شد. با كلون‌سازي ژن‌هاي موردنظر در اين مكان، اين ژن‌ها به صورت پلي‌سيستروني با ژن BADH بيان خواهند شد و علاوه بر اينكه انتقال ژن به پلاستيد بدون نشانگر انتخابي آنتي‌بيوتيكي امكان‌پذير مي‌گردد، انتظار مي‌رود گياهان تراريخته حاصل در اثر بيان ژن BADH به شوري، خشكي و سرما نيز مقاوم گردند.

In most studies related to plants transformation, the antibiotic resistance genes are used for recovery of transgenic plants, but introducing such products into the food chain may lead to biosafety concerns. In this study, Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BADH) gene was used as non-antibiotic marker in designing of Plastid vector. The gene sequences from spinach after introns removal decreased from 6111bp to 1494bp, then the codon optimization was performed based on common codon used in the Plastid Genome and eight of internal restriction enzyme recognition sites in coding region were also removed by changing the nucleotide sequences without changing the amino acids. Increasing of TA percent was also considered in this codon optimization. The final sequence of BADH gene was connected to 5ʹUTR of T7gene10 and placed under strong Prrn chloroplast promoter by SOEing PCR. RBS and MCS were inserted between promoter and BADH. By cloning of desired genes in this position, expression of them will be polycistronic with BADH and not only Plastid transformation will be possible without antibiotic selective marker, but also we would expect transgenic plants that express BADH, to be resistant to salt, drought and cold stresses.