همسانه‌سازي و مطالعه ويژگي هاي بيوانفورماتيكي ژن عامل آنزيم تروپينون ردوكتاز 2 (TR II)از گياه بنگدانه (Hyoscyamus niger)

Cloning and Study the Bioinfomatic Trait of Tropinone Reductase-II (TR II) Gene from Hyoscyamus niger

هدف: هدف از اين پژوهش استخراج و همسانه سازي ژن تروپينون ردوكتاز 2 (tr-II) در جهت آنتي سنس در ناقل دوتايي pBI121 جهت تهيه گياهان تراريخت با توانايي كاهش آنزيم TR-II و توليد بيشتر آلكالوييدهاي هيوسيامين و اسكوپولامين در پروژه هاي آينده بود. مواد و روش ها: RNA كل از ريشه‌هاي كشت شده گياه بنگدانه بومي ايران استخراج و ژن هدف پس از ساخت cDNA و همسانه-سازي در جهت آنتي سنس در ناقل دوتايي pBI121، به اگروباكتريوم توميفسينس سويه GV3101 منتقل شد. درستي همسانه‌سازي به سه روش هضم آنزيمي، PCR و توالي‌يابي نوكليوتيدي مطالعه گرديد. سپس خصوصيات بيوانفورماتيكي ژن مورد بررسي قرار گرفت. نتايج: واكنش PCR، هضم آنزيمي و توالي يابي نوكليوتيدي درستي همسانه سازي ژن هدف را با سودمندي بالا تاييد كرد. توالي نوكليوتيدي نشان داد كه ژن هدف بطول bp 783 بوده و باستثناي يك نوكليوتيد، مشابه با نمونه ثبت شده در بانك جهاني NBCI است و يك پروتيين با 260 اسيدآمينه را رمز مي كند. وزن مولكولي و نقطه ايزوالكتريك پيش بيني شده پروتيين به ترتيب برابر 4/28437 دالتون و 46/5 بود. بررسي ساختارهاي دو بعدي و سه بعدي نشان داد كه پروتيين كاملا مشابه با آنچه كه قبلا در پايگاه PDB ثبت شده بود، نبود. هم چنين، نتايج بررسي هاي فيلوژنتيكي نشان داد كه اين ژن به گروه I تروپينون ردوكتازها تعلق دارد. نتيجه گيري: با توجه به همسانه سازي موفقيت آميز و مشابهت بالاي توالي نوكليوتيدي و پپتيدي ژن tr-II با نمونه هاي ثبت شده جهاني، انتظار مي‎رود مراحل بيان ژن در نيل به هدف اصلي نيز با موفقيت همراه باشد.

Aim: The purpose of present research was extraction and cloning of tropinone reductase-II gene (tr-II) at antisense direction in pBI121 binary vector to provide transgenic plants with low rate of tropinone reductase-II enzyme and high production of scopolamine and hyoscyamine for future projects. Material and methods: Total RNA was extracted from Iranian native Hyoscyamus niger roots, and the interest gene after cDNA synthesis and cloning at antisense direction in pBI121 binary vector, was transfered to Agrobacterium tumefacience. Accurate cloning was studied through 3 methods; enzymatic digestion, PCR and DNA sequencing. The bioinformatic characters of the gene were then surveyed. Results: Three used methods confirmed true cloning in high efficiency. Nucleotide sequence of the gene revealed the 783 bp in length, encoding a polypeptide of 260 amino acid residues, with high similarity to that one registered in NCBI. The predicted molecular mass and isoelectric point of deduced polypeptide were 28437.3 Da and 5.46, respectively. Protein structures were not completely similar to those previously reported at PDB data base. Also, phylogenic study demonstrated that this gene belongs to the group I of TRs. Conclusion: Due to successful cloning and high similarity of nucleotide and polypeptide sequences of gene with those recorded in world data bases; it is expected to get success in access to main purpose. Keywords: Agrobacterium, Antisense, Bioinformatics, Cloning, Hyoscyamus niger, Tropinone reductase II, TR-II