مقايسه كمي حساسيت NASBA-ELISA و RT-PCR-ELISA در اندازه گيري رونويس الحاقي ژن هاي BCR-ABL بيماران مبتلا به CML

Quantitative comparison of NASBA-ELISA and RT-PCR-ELISA sensitivities for measurement of the BCR-ABL genes fusion transcript in CML patients

سابقه و هدف: بيماران مبتلا به لوسمي ميلوييدي مزمن (CML) داراي كرموزوم فيلادلفيا هستند. اين كروموزوم حاصل جابجايي بازوهاي بلند كروموزوم هاي 9 و22 (q34;q11) بوده كه منجر به ايجاد الحاق بين ژنهاي BCR و ABL مي گردد. در اين مطالعه، تكنيك هاي RT-PCR و NASBA در تعيين رونويس هاي bcr-abl مقايسه شد. روش بررسي: رونويس هاي الحاقي بطور مصنوعي سنتز و RNA از رده سلولي لوسميك K562 استخراج گرديد. سريال رقت هم از رونويس هاي الحاقي سنتز شده و هم RNA استخراج شده تهيه شد و سپس حساسيت هر دو تكنيك تعيين گرديد. محصولات واكنش RT-PCR و NASBAبا نسبت برابري به ترتيب با DIG-11-dUTP و DIG-11-UTP نشاندار شد. بدنبال دناتوراسيون، واكنش هيبريداسيون با پروب اختصاصي روي هر دو محصول انجام شد. محصولات در ميكروپليت هاي پوشيده شده با استرپتواويدين انكوبه شد. پس از شستشو پليت ها، آنتي ديگ كونژوگه با پراكسيداز اضافه و با استفاده از سوبسترا ATBS فعاليت آنزيمي در طول موج 405 نانومتر تعيين شد. يافته ها: اختصاصيت هر دو روش يكسان بود، اما حساسيت RT-PCR-ELISA 100 برابر بيشتر از روش NASBA-ELISA بود. به عبارتي RT-PCR-ELISA توانست 100 پيگوگرم RNA كمتري را نسبت به NASBA-ELISA (006/0 در مقابل 06/0 پيكوگرم RNA) را شناسايي نمايد. هم چنين ميزان شناسايي سلول هاي لوسميك توسط اين دو روش به ترتيب 4 و 400 سلول بود. نتيجه گيري: با وجودي كه NASBA به ترمال سيكلر نيازي ندارد، اما حساسيت آن كمتر از روش RT-PCR بوده و نمي تواند روش مناسبي براي ارزيابي كمي باشد.

Background: Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by neoplastic overproduction of myelocytes and neutrophils. Affected patients have a Philadelphia chromosome which arises following a translocation between long arms of chromosome 9 and 22 (q34;q11). This results in abelson murine/breakpoint cluster region (BCR/ABL) fusion. Detection of cells carrying BCR/ABL fusion is extremely important in monitoring response to treatment, remission and relapse in CML patients. In this study, we compared RT-PCR and NASBA techniques to determine quantitatively the number of bcr/abl transcripts. Materials and Methods: Fusion transcripts were synthesized and RNA was extracted from K562 leukemic cell line. A serial dilution of both fusion transcript and RNA was prepared; then sensitivities of both techniques were determined. RT-PCR and NASBA reaction products were labeled using equal ratios of DIG-11-dUTP and DIG-11-UTP respectively. Following denaturation, hybridization reactions were carried out with specific probes. The products were incubated in streptavidin coated microplates. Then, the plates were washed, anti-DIG conjugated with peroxidase added and using ATBS as substrate, enzymatic activity was determined by absorption at 405 nm. Results: The results showed that specificity of two techniques was equal but RT-PCR-ELISA sensitivity was about 100-fold more than NASBA-ELISA as it could detect 100 pg RNA less than NASBA-ELISA (0.006 versus 0.06 pg RNA). Furthermore, leukemia cell detection precision by RT-PCR-ELISA and NASBA-ELISA was 4 and 400 cells, respectively. Conclusion: While NASBA technique does not need thermal cycler PCR but has less sensitivity than RT-PCR and is not suitable for quantitative assessment.