بررسي اثرات زهر زنبورعسل و ويتامين D3 بر سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي بندناف و تمايز به سمت استيوبلاست

Study of Bee Venom and vitamin D3 Differentiating Effects on Mesenchymal Stem Cells Derived from Umbilical Cord to Osteoblast Cells

بند ناف از مهم‌ترين منابع سلول هاي بنيادي مزانشيمي است. اين سلول ها در صورتي كه تحت شرايط خاص قرار گيرند، توان تمايز به بافت هاي مختلف را دارند. در پژوهش‌هاي گذشته اثر تمايزي ويتامين D3 بر روي سلول‌هاي بنيادي استخوان اثبات شده است. هم‌چنين نشان داده شده است كه زهر زنبور (BV) سبب تمايز سلول هاي سرطاني مي گردد. در بررسي حاضر اثر تمايزي BV و ويتامين D3‌ بر روي سلول هاي بنيادي بند ناف استيوبلاست بررسي شد. براي انجام اين تحقيق بافت‌هاي بند ناف حاصل از 12-10 جنين موش پس از هضم آنزيمي در محيط DMEM‌ كشت داده شدند. براي اثبات بنيادي بودن اين سلول ها فاكتور OCT4 جنيني و براي اثبات مزانشيمي بودن آن‌ها حضور ماركرهاي سطحي CD29، CD44 و CD73 به‌روش فلوسيتومتري بررسي شد. نتايج بيان بالاي فاكتور‌هاي فوق را در اين سلول ها نشان داد. پس از پاساژ دوم، براي بررسي تمايز، سلول ها با غلظت هاي مختلف BV، ويتامين D3 و هم افزايي اين دو تركيب به‌مدت 21 روز تيمار شدند. در ابتدا براي به‌دست آوردن دوز هاي مناسب BV، اثرات كشندگي آن بر سلول ها با روش MTT‌بررسي شد و مشخص شد كه BV در غلضت هاي بيش‌تر از ?g/ml6 موجب مهار رشد سلول‌هاي مزانشيمي مي-گردد. سپس سطح كلسيم سلول ها توسط رنگ آميزي آليزارين‌رد بررسي شد. علاوه بر اين ميزان آلكالين فسفاتاز به‌عنوان يك ماركر استخواني اندازه‌گيري شد. با استفاده از رنگ آميزي آليزارين رد و تست آلكالين فسفاتاز اثبات شد كه BV با غلظت هاي غيرسمي (?g/ml2 ،?g/ml4و ?g/ml6) موجب تمايز اندكي در سلول هاي بنيادي بند ناف به سمت استخوان موجب مي شود. در صورتي كه استفاده توام BV با ويتامين D3 موجب افزايش قدرت تمايزي اين ويتامين مي-گردد. در نتيجه، پيشنهاد مي شود سلول هاي بنيادي بند ناف در صورتي كه تحت تيمار هم‌زمانBV و ‌ويتامين D3 قرار بگيرند توانايي تمايز به سمت سلول هاي استخوان ساز را داشته و در نتيجه مي توانند در سلول درماني كاربرد داشته باشند.

Umbilical cord (UC) is an important source of multipotential mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs can be differentiated into different types of cells if they cultured under speci?c conditions. It has been proved that vitamin D3 can cause differentiation of stem cells in to osteoblast. Also, it has been observed that bee venom (BV) is effective in differentiation of cancerous cells. In this study differentiating potential of BV and vitamin D3 on MSCs to osteoblast was examined. Furthermore, our hypothesis was that BV could increase differentiating potential of vitamin D3. The cells obtained from UC tissues of 10-12 mouse embryos which were digested enzymatically and suspended in DMEM medium. For approving of stem cells, embryonic Oct4 marker was checked and the mesenchymal character of these cells was proven by surface markers including CD73, CD29, CD44. The flowcytometric analysis revealed high levels of these markers. After the second passage, in order to induce osteogenic differentiation, cells were cultured for 21days in DMEM medium containing different concentrations of BV, vitamin D3 separately and BV/vitamin D3 together. At first, cytotoxic effects of BV on MSCs were tested by MTT assay, which were shown that BV inhibited MSCs growth at higher concentrations than 6?g/ml. Following the treatment, calcium’s level in the cells was determined by Alizarin red staining. Also, as an osteogenic marker, alkalin phosphatase level was measured in treated and non-treated cells. By Alizarin red staining and alkalin phosphatase assay, we found that BV With non-toxic concentrations (2µgr/ml, 4µgr/ml and 6µgr/ml) can cause a few osteogenic differentiation of MSCs. Whereas, usage of BV/vitamin D3 together, caused increasing the differential effects of vitamin D3. In conclusion we suggest that if MSCs were treated with bee venom and vitamin 3 at the same time, these components able to differentiate MSCs to osteoblast, therefore, they could be useful in cell therapy.