مقايسه خاموش كننده هاي فلورسنت و غيرفلورسنت روش Real-time PCRدر پلات هاي آمپليفيكيشن استاندارد ژن دلتا-6 دساتوراز در كشت سلولي رده PANC-1

Comparison of Real-time PCR fluorescent and non-fluorescent quenchers in standard amplification plots of delta-6 desaturase gene in PANC-1 cell line culture

زمينه: استفاده از خاموش كننده هاي غيرفلورسنت در روش Real-time PCR براي بررسي بيان ژن مناسب است. هدف: مطالعه به منظور مقايسه توانايي دو نوع خاموش كننده فلورسنت و غيرفلورسنت با توجه به نتايج Real-time PCR انجام شد. مواد و روش ها: اين مطالعه تحليلي در سال 1391 در آزمايشگاه رفرانس دانشگاه علوم پزشكي قزوين انجام شد. سلول هاي سرطاني پانكراس انسان ((PANC-1 در فلاسك هاي 75 سانتي متري كشت و تكثير شدند. سپس 106×3 سلول در پليت هاي 6 خانه اي تحت تاثير داروهاي موثر بر سيگنال هاي خاص درون سلولي قرار گرفتند و ميزان تغيير بيان ژن دلتا-6 دساتوراز در شرايط يكسان، يك بار با خاموش كننده فلورسنت و بار ديگر با خاموش كننده غيرفلورسنت با روش Real-time PCR بررسي شد. داده ها با آزمون آماري تي و براساس روش??CT با فرض كارآيي 100 درصد تحليل شدند. يافته ها: خاموش كننده هاي فوق، با جذب متفاوت نشر گزارش گر (Reporter)، باعث تفاوت در نتايج حاصل از Real-time PCR شدند. پلات آمپليفيكيشن هنگام استفاده از خاموش كننده غيرفلورسنت، دقيق تر و ميزان خط پايه (Base line) پايين تر بود و به اين ترتيب نسبت سيگنال به noise كاهش يافت. با استفاده از خاموش كننده غيرفلورسنت، به دليل افزايش دماي ذوب (Tm) و كاهش اتصالات غيراختصاصي، ميزان عددي دوره آستانه (CT) نيز كاهش يافت. نتيجه گيري: با توجه به يافته ها، استفاده از خاموش كننده غيرفلورسنت نسبت به فلورسنت مناسب تر و جاي گزين بهتري براي خاموش كننده-هاي متداول، به خصوص در مطالعه هاي تشخيصي آلل ها و SNP (single nucleotide polymorphism) بود.

Background: Employing non-fluorescent quenchers in Real-time PCR is appropriate for gene expression examination. Objective: The objective of this study was to compare Real-time PCR fluorescent and non-fluorescent quenchers in standard amplification plots of delta-6 desaturase gene in PANC-1 cell line culture. Methods: This analytical study was conducted in the Reference Laboratory affiliated to Qazvin University of Medical Sciences in 2012. Human pancreatic cancer cells (PANC-1) were cultured in 75 cm2 flasks, 3x106 cells were seeded in 6-well plates and were treated with specific intracellular signaling drugs. Changes in expression of delta-6 desaturase gene were examined with fluorescent and non-fluorescent quenchers using Real-time PCR in equal conditions, separately. Data were analyzed using student T-test and gene expression results were analyzed using ??CT method with the assumption of 100% efficiency. Findings: Employed quenchers showed different absorption of the fluorescence emitted by the reporter and caused different results in Real-time PCR. Using non-fluorescent quencher, the amplification plot was more precise and its baseline was lower. Therefore the signal to noise ratio (S/N) was decreased. Also, the Threshold cycle (Ct) value was lower because of increased Tm (melting temperature) and decreased non-specific bindings. Conclusion: With regards to the results, non-fluorescent quencher is more appropriate compared to fluorescent quencher and can be a better alternative for current quenchers especially in allelic discrimination and SNP (single nucleotide polymorphism) studies.