بهينه سازي بيان، تخليص و بررسي خاصيت ضد ميكروبي پروتيين نوتركيب بتا ديفنسين 2 نوتروفيل‎هاي گاو

Optimization of expression, purification and handling anti bacteria feature protein of bovine neutrophil B-defensing BNBD2

زمينه و هدف: ديفنسين‎ها يكي از بزرگ‎ترين خانواده‎ي پپتيد‎هاي ضد ميكروب مي‎باشند كه به واسطه‎ي فعاليت بر عليه باكتري‎ها، قارچ‎ها و بسياري از ويروس‎ها به عنوان آنتي‎بيوتيك‎هاي نسل جديد منفعت بسياري دارند. هدف از اين مطالعه بهينه سازي بيان، تخليص و بررسي خاصيت ضد ميكروبي پروتيين بتا ديفنسين 2 نوتروفيل‎هاي گاو (BNBD2) بوده است. روش بررسي: در اين مطالعه‎ي تجربي-آزمايشگاهي باكتري اشرشياكليBL21(DE3) حامل وكتور pET-32a(+) كه ژن BNBD2 در آن همسانه سازي شده بود جهت مطالعات مورد استفاده قرار گرفت. بيان پروتيين BNBD2 با تغيير در پارامترهاي دانسيته‎ي سلولي، دماي رشد، مدت زمان القا با استفاده از سيستم الكتروفورز عمودي (SDS-PAGE) و تست برادفورد به صورت كمي و كيفي بررسي گرديد. مراحل تخليص پروتيين نوتركيب با كمك روش شيميايي شكافت در جايگاه فرميك اسيد و عبور از سانتريكون و اثر ضد باكتري پروتيين تخليص شده بر چند نمونه‎ي باكتريايي گرم مثبت و گرم منفي مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: با استفاده از محيط كشت Luria–Bertani، شروع القا در جذب نوري 8/0 در طول موج 600 نانومتر، غلظت يك ميلي مولار ماده‎ي القا كننده‎ي IPTG، دماي رشد 30 درجه و مدت زمان 4 ساعت پس از القا بيشترين ميزان بيان پروتيين به دست آمد. پروتيين نوتركيب با استفاده از شكافت در جايگاه فرميك اسيد و عبور از سانتريكون تخليص گرديد. نتايج آزمايش وسترن بلاتينگ نيز نشان داد كه پروتيين نوتركيب به طور اختصاصي به آنتي‎بادي mouse anti-(His)6 peroxidase متصل مي‎گردد. تشكيل هاله‎ي عدم رشد در محيط‎هاي كشت مولر هينتون آگار حاوي كشت سطحي باكتري هاي مورد آزمايش خاصيت ضد باكتري اين پروتيين را نشان داد. نتيجه گيري: با توجه به خاصيت ضد ميكروبي پروتيين BNBD2و امكان بيان پروتيين در باكتري E. coli مي توان به توليد انبوه اين پروتيين نوتركيب اقدام نمود

Background and aims: Defensins are one of the largest families of antimicrobial peptides and, because of their activity against bacteria, fungi, and many coated and uncoated viruses, are very profitable as new antibiotics. This study was done to evaluate the optimization of expression, purification and handling antibacterial features of BNBD2 protein. Methods: In this experimental laboratory study, E. coli BNBD2 (DE3) carrying pET-32a(+) vector in which BNBD2 was homogenized was used. BNBD2 expression was evaluated through changes in cell density, growth temperature, the duration of induction using vertical electrophoresis (SDS-PAGE) and Bradford test both qualitatively and quantitatively. The purification of recombinant protein was done by chemical method of fission in the position of formic acid and passing Centricon, and anti-bacterial effect of the purified protein on some gram negative and gram positive bacteria was examined Results: By induction start in optical absorption of 0.8 in wave length of 600 nm and inducing IPTG in concentration of 1 milimolar, growth temperature of 300C, and duration of 4h after induction, the highest expression was obtained in Luria-Bertani culture medium. The recombinant protein was purified by fission in formic acid and passing centricon. Western blot test results indicated that the recombinant protein was specifically connected to mouse anti-(His) 6 peroxidase antibody. The formation of inhibition zone in culture media of Hinton agar containing culture swab of the studied bacteria indicated this protein’s antibacterial property. Conclusion: BNBD2 protein has antibacterial effects and can be expressed in E .coli and this protein has antibacterial effects.