تشخيص مولكولي و تعيين توالي اسيدهاي آمينه ناحيه شكافتگي هماگلوتينين در ويروس آنفلوانزاي جداشده از طيور گوشتي استان خراسان شمالي

Molecular Diagnosis and Determination of Amino Acid Sequence of Hemagglutinin Cleavage Site of Avian Influenza Viruses Isolated from Broilers in North Khorasan Province

بيماري آنفلوانزاي پرندگان يكي از بيماري هاي ويروسي مهم در مرغداري هاي صنعتي كشور مي باشد و هر سال خسارات عمده اي به صنعت پرورش طيور كشور وارد مي‌كند.تشخيص سريع ويروس آنفلوانزا و تعيين حدت آنها يكي از اولويت هاي مهم پيشگيري و مبارزه عليه اين بيماري در كشور محسوب مي شود. از آزمايش RT-PCR جهت تشخيص ويروس هاي آنفلوانزا و نيز بررسي تواالي محل شكافتگي پروتيين هماگلوتينين (HA) به عنوان يك شاخص مولكولي به منظور پيش بيني حدت سويه هاي آنفلوانزا مورد استفاده قرار گرفت. در اين تحقيق جهت پايش بيماري آنفلوانزا 160 نمونه سوآپ ناي از 20 واحد پرورش مرغ گوشتي در استان خراسان شمالي كه مشكوك به بيماري آنفلوانزا بودند اخذگرديد. آزمايش مولكولي RT-PCR براساس ژنوتيپ هاي شايع در ايران پايه ريزي گرديد كه در آن براي تعيين تيپ گروه A آنفلوانزا از پرايمراختصاصي ژن ماتريكس (M)وجهت تعيين تحت تيپ هاي H9، H5 ، H7 از پرايمرهاي اختصاصي ژن هماگلوتنين(HA) استفاده شد. جهت تعيين توالي، نمونه هاي مثبت شده از نظر تيپ Aبه تخم مرغ جنين دار (SPF) 9-11 روزه تزريق شد، پس از سه تاپنج روز مايع آلانتوييك با استفاده از فرمالين 1درصد خنثي و جهت بررسي تست هماگلوتيناسيون و استخراج RNAي ويروسي استفاده گرديد. سپس قطعه اي به طول 437bp دربرگيرنده محل شكافتگي ژن هماگلوتينين تكثير و جهت تعيين توالي نوكليوتيدي به شركت MWGآلمان ارسال شد و درنهايت به توالي اسيدآمينه اي ترجمه گرديد .نتايج نشان دادكه با استفاده ازروش RT-PCR نمونه هاي اخذشده از 4 مرغداري صنعتي از نظر ويروس تيپ A آنفلوانزا مثبت بودند. تمام ويروس هاي تيپ Aاز نظر تحت تيپ H5 ، H7 ، منفي و از لحاظ H9 مثبت تشخيص داده شدند. بررسي محل شكافتگي پروتيين هماگلوتينين نشان دادكه هر4 سويه داراي توالي KSSR بودند، اگرچه اين توالي نشان دهنده غيرحاد بودن سويه ها مي باشد ولي با الگوي جدايه هاي قبلي ايران كه عمدتا RSSR مي‌باشد تفاوت داشت. به طوركلي آزمايش RT-PCR با استفاده ازپرايمرهاي اختصاصي تحت تيپ هاي رايج درمنطقه، تشخيص تفريقي سريع ويروس‌هاي آنفلوانزا را امكان پذيرمي سازد. تغيير در محل شكافت پروتيين هماگلوتينين درويروس هاي H9N2 را مي‌توان به عنوان يك خطر بالقوه جهت تبديل اين ويروس ها به سويه هاي حاد در نظرگرفت .لذا پايش مستمر توالي ژنتيكي اين ويروس ها توصيه مي گردد.

Avian influenza virus has been recognized as one of the most important pathogen in poultry that caused economic losses to the poultry industry of Iran. Rapid detection and pathotyping is the important priority in order to prevent extension of disease in Iran. RT-PCR method was used for the rapid detection of influenza viruses. The amino acid sequence of cleavage site of hemagglutinin was considered as a molecular determinant for the prediction of pathogenicity influenza viruses. In this study, 160 tracheal swabs samples were taken from 20 poultry farm to monitor influenza infection in North Khorasan province. RT-PCR assay was developed based on the most common genotype in Iran detecting type A and H9, H5 and H7 subtypes by specific primers targeting Matrix (M) and Hemagglutinin(HA) genes, respectively. The samples which were positive as type A influenza inoculated to embryonated eggs of 9-10 days. After 3-5 days, the allantoic fluids were tested with Hemagglutinin assay. The samples that contained HA activity were inactivated with formalin 0.1%. These fluids were used for RNA extraction. A segment of 432bp was amplified by RT-PCR and nucleotide sequencing. The results showed that four poultry farms were positive for type A of influenza virus. All of them were negative for H5 or H7 but positive for H9 virus. The sequence analysis of hemagglutinin revealed that four isolates shared a KSSR motif at the cleavage site of HA. Although this motif represented low pathogenicity in poultry, it was different from previous Iranian isolates. As a result RT-PCR assay based on common genotype in region was considered as a rapid test for the detection of influenza viruses. The cleavage site sequence analyses indicated that these viruses have the potential for emerging highly pathogen influenza viruses. Therefore, continuous monitoring of viruses is being recommended