همسانه‌سازي، بيش بيان و بررسي خصوصيات آنزيم قليايي فيتاز (phyC) در باكتري اشرشيا كلي

Cloning, over Expression and Characterization of Alkalin Phytase Enzyme in Escherichia Coli

چكيده فيتاز (مايواينوزيتول هگزا كيس فسفات فسفو هيدرولاز) آنزيمي هيدروليزي است كه فسفات معدني توليد مي‌كند. ژن كد كننده فيتاز phyC از باكتري باسيلوس سابتيليس ATCC12711 جداسازي و توالي يابي شد. توالي نوكلوتيدي ژن فيتاز حاوي ناحيه كدكننده به طول 1089 جفت باز است كه 90 نوكلوتيد ابتدايي آن، مربوط به سيگنال پپتيد ژن مي‌باشد. به منظور توليد آنزيم فيتاز نوتركيب، ژن هدف به وكتور بياني pET32a (+) وارد شد و وكتور نوتركيب پس از تكثير در باكتري اشرشيا كلي DH5? به باكتري اشرشيا كلي BL21(DE3) به عنوان ميزبان بيان منتقل شد. تحريك بيان ژن با استفاده از IPTG در غلظت نهايي 1 ميلي مولار در دماي 30 درجه سانتي گراد و حضور كلريد كلسيم 10 ميلي مولار صورت گرفت. نمونه‌گيري در زمان‌هاي صفر تا پنج ساعت انجام شد و ميزان توليد پروتيين نوتركيب با استفاده از الكتروفورز بررسي گرديد. فيتاز محلول حاصل از ژن phyC-Trx با موفقيت به شكل درون‌سلولي در باكتري اشرشيا كلي بيان شد. وزن مولكولي فيتاز نوتركيب توليد شده در حدود 64 كيلو دالتون تخمين زده شد. اندازه گيري فعاليت آنزيمي با استفاده از روش استاندارد فسفاتاز، فعاليت آنزيم نوتركيب توليد شده را 44/7 واحد در ميلي‌ليتر نشان داد. همچنين pH بهينه براي فعاليت آنزيم فيتاز قليايي نوتركيب در حدود 7 برآورد شد. نتايج نشان داد كه فيتاز بدست آمده از باكتري باسيلوس سابتيليس به جهت پايداري حرارتي و همچنين هزينه پايين توليدي گزينه مطلوبي جهت استفاده در صنعت مي‌باشد.

Abstract Phytase (myo-inositol hexakisphosphate) is the hydrolysis enzyme of phytic acid that produces inorganic phosphate. The gene phyC encoding phytase was isolated from Bacillus subtilis ATCC12711 genomic library and sequenced. The nucleotide sequence of the phytase gene contained an open reading frame of 1089 bp, which codes for 90 bp signal peptide and a mature protein with a deduced molecular mass of 42 kDa. Target gene was inserted in pET32a (+) as expression vector and transformed to Escherichia coli BL21 (DE3) as host expression. The fusion phytase phyC-Trx gene was successfully overexpressed in E. coli as an active and cytoplasmic phytase. Recombinant protein production was induced with 1mM IPTG in shaking ?asks at 300C in presence of 10 mM calcium. Samples were taken at 0-5 h after induction by 1 hour time intervals, and then protein electrophoresis was done. phyC-Trx protein was expressed in the cytoplasm of E. coli successfully. Molecular weight of recombinant phytas was estimated about 64 kDa. Phytase activity was 7.44 U/ml with using standard phosphates method. Optimum pH for the degradation of phytate was 7. The results of current study showed that thermal stability and cost effective production make this enzyme attractive for using in feed supplements.