تهيه آزمايشگاهي وكتور T/A براي تسهيل همسانه سازي قطعات DNA حاصل از PCR

A home-made T/A vector for simplification of cloning DNA fragments obtained from PCR

امروزه مهندسي ژنتيك جز اجتناب ناپذير پژوهش هاي زيست شناسي نوين ميباشد و همسانه سازي به عنوان يكي از اصلي ترين بخش هاي اين علم، كاربرد گسترده اي دارد. پلاسميدها يكي از پر كاربردترين حامل ها ميباشند كه امكان تكثير ژن مورد نظر را به صورت نامحدود در ميزبان عمدتا" باكتريايي فراهم ميكنند. وكتورهاي T/A نوعي از حامل هاي پلاسميدي ميباشند كه امكان همسانه سازي قطعه دي ان اي تكثير شده با آنزيم Taq DNA polymerase (در واكنش زنجيره اي پليمراز) را تسهيل مي كنند. با توجه به محدوديت امكانات، خريد كيت همسانه سازي حاوي اين پلاسميد ممكن است به سختي ميسر باشد. به همين جهت تهيه اين وكتور با كارايي خوب در آزمايشگاه حايز اهميت است. در اين پژوهش، بعد از تهيه سلول هاي مستعد (رقيب) از باكتري Escherchia coli، پلاسميد حلقوي و فاقد قطعه خارجي pTZ57R به اين سلول ها ترانسفورم گرديد. پس از استخراج پلاسميد به روش ليز آلكاليني، با آنزيم EcoRV پلاسميد برش داده شده و خطي گرديد. سپس آنزيم برشي غيرفعال گرديد و نوكليوتيد تيمين به انتهاي آزاد اين پلاسميد خطي اضافه شد. سپس كارايي حامل تهيه شده طي واكنش اتصال دي ان اي به پلاسميد و متعاقب آن، ترانسفورماسيون باكتري تاييد گرديد. بعلاوه، بخشي از ژنوم پوتي ويروس كه با جفت آغازگر يونيورسال مورد تكثير قرار گرفته بود در پلاسميد ساخته شده مورد همسانه سازي وترادف يابي قرار گرفت كه در مقايسه با توالي هاي هم قطار موجود در پايگاه ژن بانك بعنوان ويروس موزاييك سويا تشخيص داده شد

Today, genetic engineering is an indispensable component of modern biological research and DNA cloning, as one of the most important applications of this technology, has a wide-range application. Plasmids are the most commonly used vectors that provide replication of a desired gene usually in a bacterial host. T/A cloning vectors are one type of plasmids which facilitate cloning of a DNA fragment provided that the DNA is amplified by Taq DNA polymerase through polymerase chain reaction (PCR). In cases where the resources are limited, purchasing commercial T/A cloning kits may be hardly possible. So, availability of a home-made T/A vector with a good performance in the laboratory would be important. In this study, after preparation of competent Echerchia coli cells, the circular plasmid pTZ57R (without insert) was transformed into the cells. After plasmid extraction by alkaline lysis method, the plasmid was cut with EcoRV to make it linear. Then, the enzyme was inactivated and thymine nucleotide was added to the free 5‘ ends of the linear plasmid. The efficiency of the vector was demonstrated during ligation reactions and subsequent transformations. In addition, a segment of potyvirus genome that was amplified by a pair of universal primers was inserted into the T/A vector and subjected to sequencing. Comparison of the sequencing data with that of the counterpart regions available in GenBank has ended in identification of the virus as Soybean mosaic virus.