ترانسفورماسيون پايدار و آسان جنين بالغ برنج (Oryza sativa L.) با استفاده از روش In planta

A Stable and Simple Transformation of Rice (Oryza sativa L.) Mature Embryo using in planta Method

ترانسفورماسيون ژنتيكي برنج با استفاده از آگروباكتريوم (Agrobacterium tumefaciens) رويكردي مطلوب، ضروري و قدرتمند براي انتقال‌ژن به گياهان زراعي مي باشد. در اين پژوهش بهمنظور ترانسفورماسيون گياهان برنج از روش In planta استفاده شد. بر اين اساس، بذور برنج بهمدت دو روز خيسانده شدند و سپس سمت مريستم انتهايي بذر كه جنين بالغ برنج وجود دارد، در مراحل اوليه جوانه زني با سوزن آغشته به محلول آگروباكتريوم زخم‌زني و تلقيح شد. آزمايش با دو سويه آگروباكتريوم (EHA105 و LBA4404) حاوي پلاسميد pCAMBIAl105.1R، سه غلظت استوسيرينگون (M?200، 100 و 0)، سه رقم برنج (هاشمي، حسني و غريب) و دو روش وكيوم و بدون وكيوم بهصورت فاكتوريل و در قالب طرح كاملاً تصادفي در سه تكرار انجام شد. كارايي ترانسفورماسيون با استفاده از آزمون مقاومت بافت هاي برگي به آنتي‎بيوتيك هايگرومايسين، آزمون بافت شيميايي GUS و واكنش PCR با حداقل سه ژن مختلف بررسي شد. در نهايت، سويه EHA105 در رقم هاشمي، با حضور M?100 استوسرينگون همراه با استفاده از وكيوم بالاترين كارايي ترانسفورماسيون (46/37%) را نشان دادند. پايداري ترانس ژن در نسل بعد بررسي و به اين‌منظور 60 گياه از نسل T1 با استفاده از سه تست اشاره‌شده آزمون و ترانسفورماسيونبودن 21% آن‌ها تاييد شد.

Agrobacterium-mediated transformation technique is a powerful and essential tool for genetic transformation and transgenic plant production such as transgenic rice. In this study, an in planta transformation method was used for rice plants transformation. First, rice seeds were soaked for two days and the mature rice embryos were inoculated by means of an Agrobacterium coated needle. An experiment with factorial design including two strains of Agrobacterium tumefaciens (EHA105 and LBA4404) harboring pCAMBIAl105.1R, three levels of acetosyringone (0, 100 and 200 µM), three cultivars of rice (Hashemi, Hasani and Gharib) and two treatments of vacuumed and non-vacuumed operations was carried out in a Completely Randomized Design with three replications. Integration of the transgene into the genome of putative transgenic rice plants were confirmed using resistance of leaf tissues to Hygromycin, the histiochemical GUS assay and PCR with at least three different genes. The results obtained revealed that EHA105 strain and Hashemi cultivar, in presence of 100 µM acetosyringone in a vir genes induction medium and by using vacuum had the highest transformation efficiency of 37.46%. The stability of transformation was further analysed in T1 generation, with 21% of genotypes confirmed transgenic.