استفاده ازتكنولوژي پروتيين نوتركيب براي تهيه آنتي‌بادي اختصاصي عليه ناقل بيماري رايزومونيا در چغندرقند

Applying of Recombinant Protein Technology for Developing of Specific Antibody against Transmitting Agent of Rhizomania in Suger Beet

بيماري ريشه‌گنايي (رايزومانيا) از مهمترين بيماري‌هاي ويروسي چغندرقند مي‌باشد. عـامـل اين بيماري ويروس رگبرگ زرد نكروتيك چغندرقند مي-باشد. قارچ Polymyxa betae به عنوان تنها ناقل طبيعي اين ويروس شناخته شده است. با توجه به ماهيت پارازيت اجباري ناقل و عدم قابليت كشت در آزمايشگاه، شناسايي گياهان آلوده معمولا بر اساس مشاهده ميكروسكوپي انجام مي شود. در اين تحقيق به منظور تسهيل در روند شناسايي، آنتي بادي اختصاصي بر عليه اين قارچ با استفاده از تكنولوژي پروتيين نوتركيب توليد گرديد. پروتيين گلوتاتيون-اس-ترانسفراز (GST) اختصاصي P. betae، به عنوان آنتي‌ژن جهت توليد آنتي‌بادي به منظور شناسايي ناقل در گياهان آلوده استفاده شد. توليد انبوه پروتيين GST بصورت نوتركيب و در ميزبان باكتريايي صورت پذيرفت. ابتدا ناحيه كد‌كننده اين پروتيين با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي و از روي قالب cDNA تهيه گرديده از گياهان آلوده جداسازي گرديد. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش‌تايي هيستيدين در ناقل بياني باكتريايي همسانه‌سازي گرديده و بيان آن به صورت نوتركيب در باكتري Escherichia coli صورت پذيرفت. خالص سازي پروتيين نوتركيب GST در شرايط طبيعي غير واسرشتي و با استفاده از روش كروماتوگرافي تمايلي بر روي ستون نيكل انجام گرديد. كميت و كيفيت پروتيين نوتركيب حاصله بر روي ژل‌پلي‌اكريلاميد بررسي شد. به منظور توليد آنتي‌بادي، پروتيين نوتركيب GST خالص جهت انجام ايمني زايي در خرگوش مورد مطالعه قرار گرفت و پس از تهيه آنتي بادي با تيتر بالا، خالص سازي آن با استفاده از ستون پروتيين A صورت گرفت. نتايج آزمايشات سرولوژيكي حاكي از قابليت بالاي آنتي بادي هاي حاصله جهت شناسايي قارچ ناقل در نمونه هاي گياهي آلوده مي باشد.

Rhizomania is one of the most important Sugar beet diseases throughout the world. The disease is caused by beet necrotic yellow vein virus (BNYVV). The Polymyxa betae (Keskin) is the only natural transmitting agent of the disease between the plants. The fungus is an obligate parasite and could not be cultured in the media, then detection of fungus is done normally by microscopic observation. In order to facilitate detection process, present study is done to develop specific antibodies against this fungus by applying recombinant protein. The Glutathione-S-transferase (GST) as a specific immunogenic protein is a critical enzyme expressed in zoospores, sporangia and resting spores and could be a good candidate to develop a serological test for P. betae. For this aim, the DNA region encoding fungal GST gene was isolated and cloned into pET28a bacterial expression vector. Large scale expression of the recombinant protein was performed in Escherichia coli (Migula). Purification was carried out by applying immobilized metal affinity chromatography under native conditions. The purified recombinant GST protein was used for immunization of rabbit. Purification of immunoglobulin was performed by affinity chromatography using protein A column. The purified antibodies were applied for efficient detection of infected plant in serological assays