جداسازي، شناسايي و تعيين خصوصيت پروتياز مقاوم به حلال آلي در Bacillus sp. DAF-01

Isolation, identification and characterization of organic solvent tolerant protease from Bacillus sp. DAF-01

مقدمه: باكتري‏هاي مقاوم به حلال جزو گروه كمابيش جديدي از باكتري‏هاي اكسترموفيل هستند كه توانايي توليد پروتيازهايي مقاوم به حلال آلي را با كاربرد استفاده در بيوتكنولوژي صنعتي، براي توليد تركيبات با ارزش دارند. از اين رو، يافتن اين باكتري‏ها به تازگي مورد توجه ويژه محققان قرار گرفته است. مواد و روش‏‏ها: در اين تحقيق، از چشمه آب گرم گور، واقع در شهرستان جيرفت، نمونه برداري شد. نمونه‏ها در محيط حاوي سيكلوهگزان و تولوين به مدت سه روز كشت داده شدند. غربال‏گري باكتري‏هاي مولد پروتياز روي محيط جامد اختصاصي SKM ‏(Skim milk agar) بر اساس قطر هاله، انجام شد. بهترين گونه باكتريايي توسط روش S rDNA16 شناسايي و ميزان فعاليت پروتيازي در دماهاي مختلف، اسيديته و حلال‏هاي آلي بررسي شد. نتايج: نتايج حاصل از تطبيق ‏توالي و درخت فيلوژنتيكي نشان دادند كه گونه فوق، 97 درصد به گونه Bacillus niacini شباهت دارد. مطالعات آنزيمي نشان داد كه اين آنزيم در گستره دمايي20 تا90 درجه سانتي‏گراد فعاليت پروتيازي دارد كه بيشترين آن در دماي 60 درجه سانتي‏گراد گزارش مي‏شود. علاوه بر اين، بيشترين فعاليت پروتيازي نيز در محدوده اسيديته‏هاي 8 تا 9 و بيشترين پايداري در اسيديته 9 گزارش مي‏شود. بررسي فعاليت پروتيازي در حضور حلال‏هاي آلي متانول، تولوين، DMF، ايزوپروپانول و سيكلوهگزان نشان مي‏دهد كه ميزان فعاليت آنزيمي باقي مانده نسبت به نمونه فاقد حلال آلي بيش از 80 درصد است. بحث و نتيجه‏گيري: قابليت‏هاي گرما دوست بودن، فعاليت در اسيديته‏هاي قليايي و پايداري در حضور حلال‏هاي آلي اين پروتياز اهميت درخور توجهي براي استفاده در صنايع مختلف را دارد.

Introduction: Organic solvent-tolerant bacteria are relatively novel extermophilic microorganisms, which can produce organic tolerant protease with capacity of being used in industrial biotechnology for producing high-value compounds. Therefore, finding of these bacteria has drawn much researchers attention nowadays. Materials and Methods: In this project, samples were collected from a hot spring, located in Jiroft. Samples were incubated in medium supplemented with cyclohexane and toluene for 3 days. Screening of protease producing bacteria was performed on the specific media, SKM (Skim milk agar), based on clear area diameter. The best bacterium was identified based on 16s rDNA gene. Protease activity was considered in different temperatures, pH and organic solvents. Results: Sequence alignment and phylogenetic tree results showed that this bacteria was closely related to Bacillus niacini, with 97% homology. Enzymatic studies showed that, this enzyme was active at a wide range of temperatures, 20-90 °C and it,s optimal activity was in 60 °C. In addition, maximum protease activity was obtained in the 8-9 range of pH, and optimal stability was also at pH 9.0. Protease activity in the presence of methanol, toluene, isopropanol, cyclohexane and DMF ‏showed that, remaining activity was at least 80% compared to the control (without organic solvent) Discussion and Conclusion: Thermopilic capacity, being active in alkaline protease and high protease stability in the presence of organic solvents all herald a remarkable application for using in different industries. Key words: protease, organic solvents, thermopile, screening