طراحي و بررسي مقايسه اي روش‏هاي مولكولي تشخيص سريع مقاومت به داروهاي تزريقي ضد سل در سويه‏هاي كلينيكي ميكوباكتريوم توبركلوزيس

Designing and comparison study of rapid detection methods of resistance to injectable drugs in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis

مقدمه: در اين تحقيق، براي تشخيص سريع مقاومت به كانامايسين، آميكاسين، كاپريومايسين، چند روش مولكولي طراحي و مقايسه شدند. مواد و روش‏‏ها: از ميان 120 سويه كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس، 70 سويه براي بررسي موتاسيون‏هاي احتمالي انتخاب شدند. در روشPCR-RFLP ‏از آنزيم ajii براي تشخيص سويه وحشي و از آنزيم BstFNI براي شناسايي سويه موتانت استفاده شد. علاوه بر اين، در طراحي روش آلل اسپسيفيك هم‏زمان (mAs PCR) از سه پرايمر اختصاصي براي تعيين حالت‏هاي وحشي و نيز موتان كدون‏هاي 1401 و 1402 استفاده شد. تعدادي از سويه‏ها تعيين توالي (سكوينس) شدند. نتايج: در روشPCR-RFLP ‏از ميان 70 سويه مورد بررسي، با آنزيم BstFNI، 17 سويه موتان از ميان 24 سويه مقاوم فنوتيپي و 44 سويه غير موتان از 46 سويه، حساس تشخيص داده شدند. حساسيت اين روش 83/70 و ويژگي آن 65/95 درصد بود. آنزيم ‏ajii از ميان 52 سويه مورد بررسي، ‏12 سويه موتان از ميان 20 سويه مقاوم و 29 سويه غير موتان را از ميان 32 سويه حساس فنوتيپي تشخيص داد. حساسيت اين روش 60 و ويژگي آن 62/90 درصد بوده است. در روش آلل اسپسيفيك 23 سويه بررسي شدند. اين روش قادر به تشخيص 3 سويه موتان از ميان 6 سويه مقاوم و 12 سويه غيرموتان از ميان 17 سويه حساس فنوتيپي شد. حساسيت اين روش 50 و ويژگي آن 58/70 درصد بوده است. نتايج تعيين ترادف اثبات كننده صحت نتايج روش‏هاي مولكولي استفاده شده، بود. بحث و نتيجه‏گيري: روشPCR-RFLP ‏با آنزيم BstFNI، به عنوان يك روش سريع در تشخيص مقاومت مايكوباكتريوم توبركلوزيس به داروهاي تزريقي خط دوم درمان سل پيشنهاد مي‏شود.

Introduction: In this study, some molecular methods were designed for rapid detection of resistance to kanamycin and amikacin. Materials and methods: Among 120 clinical isolates of mycobacterium tuberculosis, 70 strains were selected for evaluation of possible mutations. A PCR-RFLP method was designed for detection of wild type (using enzyme ajii) and mutant from (BstFNI enzyme) of the isolates. Furthermore, allele specific method (as PCR) was designed for detection mutations in codons 1401 and 1402 gene rrs. Some selected isolates were sequenced. Results: In PCR-RFLP method, among the 70 strains examined by BstFNI enzyme, could detect 17 mutant strains among 24 phenotypicaly resistant and 44 non-mutant isolates from 46 susceptible isolates. The sensitivity of this method was %70.83 and specificity was %95.65 on the other hand, 12 mutant from 20 resistant strains and 29 non-mutant strains from 32 susceptible strains were detected by AjiI enzyme. The sensitivity and specificity of this method was 60 and %90.62, respectively. In MAS PCR, 3 mutants from 6 resistant strains and 12 non-mutants from 17 resistant strains were detected. The sensitivity of this method was 50 and specificity was 70.58. Results of sequencing method confirmed the results of molecular methods. Discussion and conclusion: PCR-RFLP method by BstFNI enzyme was the best method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistant to second-line injectable drugs and was recommended for routine use. Key words: Mycobacterium Tuberculosis, Kanamycin and Amikacin, resistance, PCR-RFLP