بررسي وارونگي اينترون 22 نوع I و II ژن فاكتور هشت انعقادي در بيماران

A Study of Intron 22 Inversion Type I and II of Coagulation Factor 8 Gene in Patients with Severe Hemophilia A Using IS-PCR Technique

زمينه و هدف: هموفيلي A يك اختلال خونريزي‌دهنده وابسته به جنس مغلوب است. اين بيماري به‌علت وقوع جهش در ژن فاكتور هشت ايجاد مي‌شود. وارونگي اينترون 22، شايع‌ترين جهش مسبب ايجاد هموفيلي A شديد بوده كه با استفاده از روش‌هاي Southern blot و واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز، قابل‌تشخيص است. اين مطالعه با هدف تعيين وارونگي اينترون 22 نوع I و نوع II، در بيماران هموفيلي A شديد با استفاده از روش IS-PCR انجام شد. روش بررسي: اين مطالعه روي 30 بيمار هموفيلي A با كمتر از 1% سطح نرمال فعاليت فاكتور هشت انجام شد. بعد از اخذ رضايت‌نامه از بيماران، استخراج DNA ژنومي از لوكوسيت‌هاي خون محيطي صورت گرفت. DNA‌هاي استخراج‌شده پس از حلقوي‌شدن (هضم شدن توسط BclI، سپس اتصال قطعات حاصل توسط آنزيم ليگاز)، به‌عنوان الگو براي تكثير IS-PCR مورد استفاده قرار گرفتند. يافته‌ها: در 30 بيمار هموفيلي A شديد، 40% بيماران وارونگي اينترون 22 نوع I و 6/6% بيماران وارونگي اينترون 22 نوع II داشتند. نتيجه‌گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد نوتركيبي بين اينترون (1-h22) در ژن فاكتور هشت و كپي‌هاي آن (2-h22، 3-h22) كه در جهتي مخالف با اينترون 1-h22 قرار مي‌گيرند به ترتيب سبب ايجاد وارونگي نوع II و نوع I مي‌شود كه وارونگي اينترون 22 نوع I از نوع II شايع‌تر است. همچنين با استفاده از IS-PCR به‌عنوان روشي كم‌هزينه مي‌توان در زمان صرفه‌جويي و تشخيص مولكولي وارونگي را نيز ارتقا بخشيد. اين روش در ارزيابي ناقلين، افراد بيمار و تشخيص پيش از تولد در بيماري هموفيلي A نيز كاربرد دارد.

Background and Objectives: Hemophilia A (HA) is an X-linked recessive bleeding disorder. The disease is caused by mutations in the F8 gene. Inversion of intron 22 is the most common causative mutation of severe hemophilia A, which is detectable by southern blot and polymerase chain reaction (PCR) methods. The aim of this study was to determine intron 22 inversion type I and type II inversion in severe hemophilia A patients by inverse shifting-PCR method. Methods: This study was performed on 30 patients with severe hemophilia A with less than 1% of normal level activity of Factor 8. After obtaining consent from the patients, genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes. The extracted DNAs were used as template for IS-PCR amplification after circularization (digestion by BclI and then ligation of the produced fragments by ligase enzyme). Results: In 30 severe hemophilia A patients, 40% of the patients had intron 22 inversion type I, and 6.6% of the patients had intron 22 inversion type II. Conclusion: The results of this study revealed that recombination between intron 22h-1 within the F8 gene and its copies (22h-2 and 22h-3), which lie in opposite direction to intron 22h-1, respectively cause the inversions of intron 22 type II and type I. Inversion of intron 22 type I is more frequent than type II. Also, by application of IS-PCR as a cost effective method, we could save time and improve the molecular detection of inversion. This method and can be used for detection of carriers and patients and for prenatal diagnosis of hemophilia A disease.