انتقال ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب (Lampyris turkestanicus) به كلزا (Brassica napus L.)

Transformation of the Rapeseed (Brassica napus L.) with Firefly Luciferase Gene

پيشرفت‌هاي اخير در زيست شناسي مولكولي و زيست فناوري گياهي تصور عمومي را در مورد كاشت گياهان به صورت سنتي و فقط به عنوان يك منبع غذايي به سمت اين كه گياهان به عنوان كارخانه‌هاي زيستي جهت توليد پروتيين‌هاي نوتركيب و دارويي استفاده شوند تغيير داده است. زراعت مولكولي"Molecular farming" به توليد پروتيين‌هاي نوتركيب (اعم از دارويي و آنزيم‌هاي صنعتي ارزشمند) در گياهان از طريق مهندسي ژنتيك اطلاق مي‌شود. آنزيم لوسيفراز حشره شب‌تاب يكي از مهم ترين آنزيم‌هاي صنعتي است كه به طور وسيعي در زمينه‌هاي مختلف زيست فناوري و زيست شناسي سلولي و مولكولي به ويژه در تشخيص ميزان ATP به منظور تشخيص آلودگي‌هاي ميكروبي، تهيه كيت‌هاي تشخيص سرطان، غربال گري داروها، زيست‌حس گرها، سنجش‌هاي آنزيمي به عنوان ژن گزارشگر و در توالي‌يابي DNA (Pyrosequencing) استفاده مي‌شود. پژوهش حاضر جهت انتقال ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب جدايه ايراني Lampyristurkestanicusبه گياه كلزا انجام گرفت. در اين پژوهش ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب (LUC) كه تحت پيش برنده 35S ويروس موزاييك كلم (CaMV35S) در پلاسميد pCAMBIA1304 همسانه سازي شده بود، به اگروباكتريوم سويه LBA4404 منتقل و به وسيله Colony PCR و با آغازگرهاي اختصاصي تاييد شد. سپس پلاسميد نوتركيب شامل ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب (LUC) به روش مبتني بر اگروباكتريوم به گياه كلزا منتقل گرديد. براي تراريخت سازي، ريزنمونه‌هاي لپه‌اي گياه كلزا رقم PF4570/91 مورد استفاده قرار گرفت. جهت تعيين آستانه تحمل گياه كلزا به آنتي بيوتيك هيگرومايسين، غلظت‌هاي مختلف اين آنتي‌بيوتيك مورد بررسي قرار گرفت. گياهان تراريخت بر روي محيط MS حاوي آنتي‌بيوتيك هيگرومايسين انتخاب شدند و سپس به محيط‌هاي طويل شدن شاخه و ريشه زايي انتقال يافتند. آناليز PCR گياهان حضور ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب را در گياهان كلزاي تراريخت تاييد نمود.

Recent advances in molecular biology and plant biotechnology have shifted the concept of using crops as a food source to recruiting them as a bioreactor for the production of therapeutic recombinant proteins. "Molecular Farming" refers to producing valuable industrial enzymes and pharmaceutical proteins in plants through genetic engineering. Firefly Luciferase enzyme is one of the most important industrial enzymes being widely used in the various fields of Biotechnology and Cell and Molecular Biology, particularly in the detection rate of ATP to determine microbial pollution, the cancer identification kits, screening drugs, bioassay, sequencing of DNA (Pyrosequencing) and enzyme measuring. Luciferase gene has many applications, it is also ideal as a reporter gene in genetic engineering in order to optimize gene transfer systems. This study was done to transfer Iranian Firefly Luciferase gene (Lampyris turkestanicus) to Canola. In this study, Firefly Luciferase gene (luc) under the S35 promoter cauliflower virus (CaMV 35S) transferred to Agrobacterium strain LBA4404. Transformation was confirmed by Colony PCR with specific primers. recombinant plasmid bearing Firefly Luciferase genes (luc), was transferred to Canola by Agrobacterium-mediated transformation method. Cotyledon explants of Canola (cultivar PF4570/91) were used for transformation. For determining canola tolerance threshold, different concentrations of Hygromycin were analyzed. The transformed plants were screened on MS medium containing 7.5 mg.L-1 Hygromycin and 200 mg.L-1then transferred to regeneration and rooting medium. PCR analysis of transgenic palnts verified the presence of Firefly Luciferase (Lampyris turkestanicus(gene.