رو ش هاي همسانه سازي ژن بدون آنزيم ليگاز

Gene Cloning Methods Without Ligase Enzyme

همسانه سازي قطعه DNA موردنظر داخل يك ناقل پلاسميدي، يكي از مراحل تكنولوژي DNA نوتركيب است. در روش هاي معمول براي همسانه سازي به آنزيم ليگاز و آنزيم هاي برشي نياز است كه با محدوديت هايي مواجه هستند. راه كارهاي متعددي براي ايجاد و اتصال دو قطعه DNA مستقل بدون استفاده از آنزيم ليگاز توسعه يافته اند كه از موفق ترين آن ها فناوري هاي گيت وي و يوزرفرندلي هستند. فناوري گيت‌وي روشي سريع و موثر براي همسانه‌سازي بر اساس خصوصيت هاي نواحي ويژه نوتركيبي باكتريوفاژ لامبدا است. در اين فناوري، اجزاي سيستم نوتركيب اين ويروس براي ايجاد يك سيستم كارآمدتر تغيير يافته‌اند. نوتركيبي بين نواحي ويژه اتصال رخ مي دهد كه دو طرف قطعه DNA را احاطه مي كنند. در اين فناوري توالي DNA مورد نظر ابتدا در يك ناقل به نام ناقل ورودي همسانه‌سازي مي شود. پس از ايجاد كلون ورودي، انتقال قطعه DNA به ناقل‌هاي ديگر با واكنش نوتركيبي يك ساعته و بدون استفاده از آنزيم هاي برشي و آنزيم هاي اتصال دهنده ليگاز به راحتي انجام مي‌گيرد. در فناوري يوزرفرندلي از آغازگرهايي استفاده مي-شود كه داراي توالي ناقل هستند و يك نوكليوتيد داكسي اوريدين دارند و DNA هدف را با پليمرازي نظير تك پليمراز تكثير مي كنند. محصول PCR با مخلوط آنزيمي ويژه اي تيمار مي شودكه انتهاي 3َ تك رشته اي بر روي قطعات DNA تكثير شده با PCR ايجاد مي-كند. با اين عمل قطعات DNA داري دنباله هاي تك رشته اي طويل تر از محصولاتي هستند كه با آنزيم هاي برشي ايجاد مي شوند و براي اتصال به ناقل به آنزيم ليگاز نيازي نيست. با تغيير در طراحي آغازگرها در اين روش همسانه سازي به راحتي دست كاري هاي مختلف DNA امكان پذير است. در اين مقاله به جنبه هاي كليدي و مزاياي اين روش ها پرداخته شده است.

The cloning of a DNA fragment into a plasmid vector is a procedure in recombinant DNA technology. The most common methods for cloning require the use of DNA ligase and restriction enzymes which are less efficient. Different Ligation-free cloning methods have been developed in which of them, Gateway and USER friendly technologies have been commercialized. Gateway technology is a rapid and efficient method of cloning base on bacteriophage lambda site-specific recombination system. The components of the lambda recombination system are modified to improve the efficiency of the system. Recombination occurs between site-specific attachments. In this technology, a target fragment is cloned into a entry vector. Transfer of DNA from entry vector to other vectors easily can be done without any restriction enzymes and ligase in one hour recombination reaction. In the USER (uracil-specific excision reagent) Friendly Cloning, vector-specific PCR primers which contain one uracil per primer are designed and the target DNA is amplified with Taq DNA polymerase. The resulting PCR products are treated with the special enzyme to create unique 3´ single-stranded extensions which can then anneal to the supplied linearized vector without ligation enzyme. By varying the design of the PCR primers, the protocol is easily adapted to perform DNA manipulations. In this review key aspects and advantages of these methods are discussed.