شناسايي توالي ژنومي ويروس آنفلوانزاي اسب با استفاده از يك روش nested-PCR جديد

Detection of equine influenza viral sequences by a novel nested PCR

شناسايي سريع آنفلوانزاي اسب براي كنترل اين بيماري ضروري است. در چند سال گذشته تلاش براي جداسازي ويروس آنفلوانزاي اسب با موفقيت محدودي همراه بوده است. بعلاوه، در حيوانات واكسينه شده ممكن است تا پنج پاساژ براي جداسازي ويروس مورد نياز باشد. به منظور استفاده از يك روش سريع، قابل اعتماد و حساس براي شناسايي ويروس آنفلوانزاي اسب به عنوان جايگزين جداسازي ويروس، يك روش nested PCR (nPCR) بهينه‌سازي گرديد. اين آزمايش nPCR بدون توجه به تيپ و تحت تيپ مي‌تواند ژنوم ويروس آنفلوانزاي اسب را شناسايي نمايد. در ابتدا، تحت تيپ-1 ويروس آنفلوانزاي اسب آزمايش شد و با استفاده از پرايمرهايي كه پيشتر گزارش شده بود قطعه‌اي به طول bp244 از ناحيه conserve ژن ماتريكس ويروس آنفلوانزا تكثير شد. در قدم بعدي براي افزايش حساسيت آزمايش اول، يك جفت پرايمر داخلي جديد طراحي شد. يك قطعه bp150 در آزمايش nPCR بدست آمد. ويژگي نتايج بوسيله تعيين توالي محصول PCR مورد تاييد قرار گرفت. حساسيت اين آزمايش‌ها براي RT-PCR و nPCR به ترتيب تا حد تشخيص 55/10 و 275/5 نانوگرم از RNA ويروس در نمونه تعيين گرديد. اين روش سريع تشخيص مولكولي كه بسيار حساس نيز هست، ويروس آنفلوانزا را در مدت كوتاهي شناسايي مي‌نمايد. بنابراين مي‌تواند در تشخيص زودهنگام همه‌گيري‌هاي مشكوك به آنفلوانزاي اسب ارزشمند باشد. يك مزيت اضافي اين روش ارزش آن در شناسايي ويروس آنفلوانزاي تيپ A در ديگر گونه‌هاي حيواني مي‌باشد.

The rapid detection of equine influenza is necessary for the control of the disease. In recent years, attempts to isolate equine influenza virus (EIV) has met with limited success in horses. In addition, up to five passages may be required to isolate viruses from vaccinated horses. In order to utilize a reliable, fast and sensitive test for detection of influenza virus as an alternative technique to virus isolation, a new nested PCR (nPCR) method was optimized. This nPCR can detect influenza viral RNA in specimens regardless to types and subtypes. At first, EIV A/subtype-1 was tested and a 244 bp PCR product from conserved region of Matrix gene of the virus was amplified using primer set which was reported previously. In the next step, a new set of internal primers was designed for increasing the sensitivity of the test and a 150 bp DNA fragment was obtained in nPCR. The specificity of the results was confirmed by direct sequencing of PCR products. The sensitivity of the tests for detection of the virus was found to be 10.55 ng and 5.275 ng of the virus RNA in the sample for RT-PCR and nPCR, respectively. This rapid molecular diagnostic method, which is very sensitive, can detect influenza virus in a short time. Therefore, it would be valuable for early detection of suspected EIV outbreaks. An additional advantage of the used PCR-based methods is its value in the identification of influenza A virus from different species.