Product optimization, purification and characterization of a novel polygalacturonase produced by Macrophomina phaseolina

بهينه سازي توليد، خالص‏سازي و شناسايي پلي گالاكتوروناز از قارچ عامل بيماري ساق سياه لوبيا

مقدمه: در اين مطالعه، توليد يك پلي گالاكتوروناز از قارچ بومي عامل بيماري ساق سياه لوبيا، فعال در اسيديته 3 و مناسب براي استفاده در صنايع آب ميوه‏گيري بررسي شد. اشكال مناسب كربن، نيتروژن و فسفر شناسايي و براي توليد بهينه آنزيم به كار گرفته شد. مواد و روش‏‏ها: قارچ عامل بيماري ساق سياه لوبيا در محيط توليد كشت شد. سكروتوم قارچي جدا شد و از آن پلي گالاكتوروناز به كمك كروماتوگرافي ستوني به خلوص نسبي رسيد. فعاليت بيوشيميايي آنزيم و سكروتوم هر دو به روش كالريمتري تحليل شد. توليد پلي گالاكتوروناز با تغيير در محتوي محيط كشت، اسيديته و دما از طريق آزمايشات فاكتوريل ناقص موسوم به تاگوچي بهينه شد. سينتيك آنزيمي و پايداري دمايي و اسيديته آزمايش شد. نتايج: گستره اي از قندها به غير از گلوكز و كيتين توليد را افزايش دادند. سولفات آمونيوم و پپتون نشان دادند كه منابع مناسب ازتي هستند. در بين منابع فسفاتي، دي پتاسيم هيدروژن فسفات بيش‏ترين تاثير را نشان داد. تحليل به كمك روش آرايه هاي متعامد تاگوچي نشان داد كه اسيديته، دما، آمونيوم سولفات و عناصر ميكرو اثر معني داري در توليد پلي گالاكتوروناز داشتند. به علاوه، مقايسات ميانگين گوياي اين بود كه حالت بهينه توليد در اسيديته 6، دماي 35 درجه سانتي‏گراد، 2 گرم در ليتر آمونيوم سولفات و 2 ميلي‏گرم در ليتر عناصر ميكرو به دست آمد. بحث و نتيجه‏گيري: آنزيم خالص شده، وزن مولكولي برابر 70 كيلو دالتون داشت كه بيش‏ترين فعاليت خود را در اسيديته 3 و دماي 30 درجه سانتي‏گراد نشان مي داد. در بين كاتيون هاي مورد آزمون، آهن دو ظرفيتي فعاليت آنزيم را تا 2 برابر افزايش داد ولي عصاره قارچي پاسخ متفاوتي نشان داد. واژه‏هاي كليدي: قارچ ساق سياه لوبيا، پلي گالاكنوروناز، صنايع آب ميوه‏گيري، روش متعامد تاگوچي، خالص‏سازي و شناسايي

Introduction: Production of a novel polygalacturonase (PG) active at pH = 3.0 and suitable to be used in fruit juice industries from Macrophomina phaseolina was evaluated. Suitable carbon, nitrogen and phosphorous forms were determined and the condition was optimized for higher PG production. Materials and methods: Macrophomina phaseolina was cultured in so called production medium. The secretome was separated from fungal cells and polygalacturonase was isolated via column chromatography. The biochemical activity of both secretome and isolated polygalacturonase were assayed calorimetrically. The production of polygalacturonase was optimized via changes in culture medium in terms of contents, pH and temperature and Taguchi analysis of data. Enzyme kinetics was partially performed followed by the determination of pH and temperature stability. Results: A range of sugars except glucose and chitin demonstrated to improve the PG production. Ammonium sulfate and peptone demonstrated to be suitable nitrogen sources. Amongst phosphorous sources, dipotassium hydrogen phosphate had the greatest effect. Taguchi’s orthogonal array demonstrated that pH, temperature, ammonium sulfate and trace elements had significant effect on PG production. Furthermore, mean comparisons showed that the optimum condition achieved at pH 6.0, 35 °C, 2 g.l-1 ammonium sulfate and 2 mg.l-1 trace elements. Discussion and conclusion: The purified PG with a relative molecular mass of 70 kDa was demonstrated its highest activity at pH = 3, and 30 °C. Amongst tested cations and chemicals, Fe2+ improved the enzyme activity by 2 fold, while the secretome responded differently.