همسانه سازي و بيان ناحيه كاتاليتيك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ E در باكتري E.coli

Cloning and Expression of the Catalytic Domain of Botulinum Neurotoxin Type E in E. coli

F و E ،B ،A سابقه و هدف: باكتري هاي كلستريديوم بوتولينوم هفت نوع نوروتوكسين توليد مي كنند كه تيپ هاي منجر به بوتوليسم در انسان مي شوند. يكي از روش هاي درماني بوتوليسم مي تواند از طريق مهار فعاليت آنزيمي ناحيه E كاتاليتيك نوروتوكسين بوتولينوم توسط مهاركننده ها باشد. در اين مطالعه، ناحيه كاتاليتيك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ بيان شده است. BL21(DE سويه ( 3 E. coli همسانه سازي و در باكتري ميزبان pET28a در وكتور بياني ژنومي باكتري استخراج گرديد. با استفاده از واكنش DNA ، مواد و رو شها: به منظور همانندسازي ناحيه مورد نظر وارد و وكتور نوتركيب به سلول هاي pGEM-T Easy در وكتور PCR توالي مورد نظر تكثير شد. سپس محصول PCR به pGEM-T Easy منتقل گرديد. سپس با واكنش الحاق محصول همسانه سازي شده از وكتور DH5? سويه E.coli ميزبان انتقال داده BL21(DE سويه ( 3 E.coli به باكتري pET28a منتقل شد. در نهايت پلاسميد نوتركيب pET28a وكتور بياني شد. بيان ناحيه كاتاليتيك در شرايط استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت. بيانگر همانندسازي و زير همانندسازي به ترتيب در وكتورهاي PCR يافته ها: نتايج حاصل از برش آنزيمي و واكنش بود. نتايج تعيين توالي نيز صحت حضور توالي مورد نظر را تاييد كرد . در نهايت بيان قطعه pET28a و pGEM-T Easy و آزمايش وسترن بلات تاييد گرديد. SDS-PAGE مورد مطالعه، با استفاده از ژل با صحت كامل انجام pET28a و pGEM-T Easy استنتاج: همسانه سازي توالي مورد مطالعه، به ترتيب در وكتورهاي بيانگر صحت بيان محصول مورد نظر بود. E.coli BL21(DE گرفت. همچنين نتايج بيان و تاييد محصول بياني در باكتري (

Background and purpose: Clostridium botulinum bacteria produces seven types of botulinum neurotoxins among which types A, B, E and F are responsible for human botulism. One of the treatments for botulism is the inhibition of botulinum neurotoxins catalytic domain activity by inhibitors. In this study, botulinum neurotoxin type E catalytic domain has been cloned in pET28a vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). Materials and methods: In order to cloning of the catalytic domain, the genomic DNA was extracted. The sequence was amplified by Polymerase chain reaction (PCR) and was inserted into pGEMT Easy vector. Then, the recombinant vector was transferred to E. coli DH5? cells. Afterwards, the cloning product was removed from pGEM-T Easy vector and inserted into pET28a vector using ligation reaction. Finally, the recombinant pET28a was transferred into E. coli BL21 (DE3) cells. Expression of catalytic domain was studied in standard conditions. Results: The results of enzymatic digestion and PCR reaction confirmed that cloning and subcloning occurred in pGEM-T Easy and pET28a vectors, respectively. The process was verified by sequencing. Finally, expression of this sequence was confirmed by the sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot analysis. Conclusion: The cloning of the sequence was accurately conducted in pGEM-T Easy and pET28a vectors. Also, the results showed that the expression of this sequence has been performed properly.