بررسي عملكرد سلول‌هاي شبه عصبي حركتي مشتق از بافت چربي موش صحرايي با استفاده از رنگ‌آميزي كلسيم داخل سلولي و ارزيابي ترشح وزيكول‌هاي سيناپسي

Evaluating the function of motoneuron-like cells differentiated from rat adipose derived stem cells through calcium ion imaging and investigating the synaptic vesicle recycling

سابقه و هدف: با وجود پيشرفت‌هاي گسترده در زمينهي كشت سلول‌هاي بنيادي، هنوز انتخاب بهترين منبع سلولي كارآمد جهت تزريق، قابل تامل است. علاوه بر اين، تا كنون از نشانگر كلسيمي براي بررسي سلول‌هاي عصبي حركتي استفاده نشده است. روش‌هايي كه تا كنون براي بررسي عملكرد سلولي مورد استفاده قرار گرفته همچون روش‌هاي الكتروفيزيولوژي (patch-clamp)، علاوه بر سخت بودن و وقت‌گير بودن، در هر بررسي فقط يك سلول را مورد بررسي قرار مي‌دهد. در اين تحقيق، نشانگر كلسيمي و ترشح وزيكول‌هاي سيناپسي در سلول‌هاي عصبي- حركتي مشتق از بافت چربي، با استفاده از رنگ‌آميزي FM1-43 و نشانگر كلسيمي FLUO-2 مورد بررسي قرار گرفته است. مواد و روش‌ها: از موش صحرايي نر بالغ، نژاد wistar با وزن 250-200 گرم استفاده شد. بافت چربي استخراج و سلول‌هاي بنيادي آن جداگرديد. سپس، سلول‌هاي به دست آمده از لحاظ ماركرهاي سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي و مولتي‌پوتنسي، مورد بررسي قرار گرفتند. سلول‌هاي بنيادي مشتق از بافت چربي تحت تاثير القا كننده‌هاي رتينوييك اسيد و SHH، به سلول‌هاي شبه عصبي حركتي تمايز يافتند. بعد از تمايز، سلول‌هاي توليد شده با استفاده از تكنيك‌هاي ايمنوسيتوشيمي و RT-PCR مورد تاييد قرار گرفتند. در مرحله‌ي نهايي، فانكشنال بودن سلول‌ها با توانايي برقراري ارتباط عصبي-عضلاني، ترشح وزيكول‌هاي سيناپسي و تبادلات كلسيمي، مورد ارزيابي قرار گرفت كه براي اين كار از روش‌هاي هم‌كشتي، رنگ آميزي FM1-43 و نشانگر كلسيمي FLUO-2 استفاده گرديد. يافته‌ها: سلول‌هاي عصبي- حركتي مشتق از بافت چربي، تمام ماركرهاي مزانشيمي و اختصاصي چربي را بيان مي‌كنند و توانايي تمايز به ساير رده‌هاي سلول‌هاي مزانشيمي شامل سلول استخواني، غضروفي و چربي را دارند. اين سلول‌ها، بعد از تمايز به سلول عصبي- حركتي، ماركرهاي islet-1، oligo-2 و HB9 را بيان مي‌كنند. همچنين، داراي توانايي برقراري ارتباط عصبي- عضلاني، ترشح وزيكول‌هاي سيناپسي و تبادلات كلسيمي مي‌باشند. نتيجه‌گيري: نتايج بدست آمده نشان مي‌دهد كه سلول‌هاي عصبي- حركتي مشتق از بافت چربي، توانايي برقراري ارتباط عصبي- عضلاني، ترشح وزيكول‌هاي سيناپسي و تبادلات كلسيمي را داشته و يك سلول فانكشنال مي‌باشند.

Background and Aim: Cell replacement therapy has provided the basis for future clinical applications to treat neurodegenerative diseases, such as motoneuron diseases. Induced functional motoneurons are an option for replacing the lost motoneurons. Adipose derived stem cells (ADSCs) are an appropriate source of cells for autologous cell therapy with the ability of neural differentiation. In this study we use calcium ion imaging and synaptic vesicle release in order to indicate the functionality of motoneurons from adipose derived stem cells. Materials and Methods: In the present study, ADSCs were induced to motoneuron-like cells (MNLCs) by SHH and retinoic acid (RA) as inducers. ADSCs markers such as CD90, CD 49d, CD106, CD45, were measured by immunocytochemistry analysis and their multipotency were evaluated by incubation of the ADSCs with adipogenic, chondrogenic, osteogenic induction media. In addition to RT-PCR, immunocytochemistry was utilized in order to approve the expression of islet-1, oligo-2 and HLXB9 in induced MNLCs from ADSCs. To identify the functional MNLCs, a co-culture preparation of MNLCs and myocytes, calcium ion imaging and synaptic vesicle release was used. Results: ADSCs treated with a mixture of preinducer (B27, EGF, and bFGF) and inducers factors (SHH and RA) adopted a morphology similar to motoneuron cells. Immunocytochemical staining and RT-PCR approved the treated cells expressed the motoneuron markers islet-1, oligo-2 and HLXB9. The co-cultured with myocytes indicates the formation of neuromuscular connections between MNLCs and myocytes. After two week, MNLCs showed high HLXB9 expression, indicative of full differentiation. Also, the release rate of synaptic vesicles using FM1-43 in the induced MNLCs was approved. Moreover, calcium imaging with fluo-2 results approved that functional excitatory synaptic connections can influence the activity of MNLCs. ‍Conclusion: These results indicate ADSCs can be differentiated to a functional MNLCs phenotype and may be of benefit for treatment of motoneuron diseases.