بهينه سازي شرايط كشت باكتري اشرشيا كولي براي اصلاح توليد قطعه C-D نوتركيب باكتريورودوپسين

Optimization of Cultural Condition to Improve Recombinant C-D Fragment of Bacteriorhodopsin Production in E.coli

در بررسي حاضر، بخش CD از پروتيين باكتريورودوپسين (BR) در اشرشياكولي نوتركيب بيان شد. ژن موتانت BR با در نظر گرفتن كدون مورد استفاده در اشرشياكولي ساخته شد. ژن ساخته شده در پلاسميد بياني pET21a+ در محل هاي برش Nde I و Hind III كلون شده و تحت كنترل پيش بر T7 با موفقيت بيان شد. پروتيين بيان شده با SDS PAGE تجزيه شد. اثر دما (A)، زمان القا (B) و زمان فرايند پس از القا (C) روي بازدهي ميزان بيان پروتيين (ميزان فراورده بر واحد جرم خشك سلول) با استفاده از تجزيه هاي جدول Yates غربالگري شد. سه عامل A ، B و C مهم بودند و با روش تاگوچي بهينه شدند. شرايط بهينه عبارتند از: دما oC 37، زمان القا در 7/0 OD600 = و زمان فرايند پس از القا 4 ساعت. همچنين، توليد پيش بيني شده پروتيين در شرايط بهينه، 54 /21% از كل پروتيين سلولي بود. با استفاده از شرايط بهينه به دست آمده، تاثير افزودن اسيدهاي آمينه روي ميزان بيان بخش CD نوتركيب باكتريورودوپسين و رشد باكتري در اشرشياكولي با استفاده از محيط كشت M9 مورد بررسي قرار گرفت. تجزيه و تحليل جدول Yates نشان داد كه اسيدهاي آمينه آلانين، تريونين و ليوسين داراي اثر بيشتري روي بيان پروتيين بودند و براي افزودن به محيط كشت در فرمانتور در دو سطح گوناگون انتخاب شدند. نتيجه ها نشان دادند كه افزودن اسيدهاي آمينه باعث افزايش بازدهي توليد پروتيين مورد نظر مي شود، اما تاثير ناچيزي روي رشد باكتري دارد.

At present study, a C-D fragment of bacteriorhodopsin (BR) in recombinant E. coli was expressed. BR mutant gene was synthesized by consideration of E. coli codon usage. The synthesized gene was cloned in pET21a+ expression plasmid at Nde I and Hind III restriction sites and expressed under T7 promoter successfully. The expressed protein was analyzed by SDS-PAGE. The effect of temperature (A), induction time (B) and the process time after induction (C), on the protein expression yield (the amount of product per unit dry cell mass) were screened using Yates table analysis. Three factors of A, B and C were significant and optimized by Taguchi method. The optimized condition was as: temperature 37 0C, induction time at OD600= 0.7 and the process time after induction 4 h. Also, the predicted protein production at optimized condition was 21.54% of total protein. Using the gained optimum condition, the effect of amino acid addition on expression level of recombinant C-D fragment of BR and bacterial growth in E.coli, using M9 culture medium was also investigated. Yates table analysis showed that Threonine, Leucine and Alanine are more effective and so were selected for addition to the culture medium in the fermentor, at two different levels. The results showed that amino acid addition caused increasing in the desired protein productivity, but had little effect on the bacterial growth.