بهينه‌سازي شرايط جداسازي سلول‌هاي هسته‌دار خون بند ناف جنيني با استفاده از هيدرو كسي اتيل استارچ(HES

OPTIMIZATION OF THE CONDITIONS IN ISOLATION OF NUCLEATED CELLS FROM UMBILICAL CORD BLOOD USING HYDROXYETHYL

پيش زمينه و هدف: استفاده از سلول‌هاي خون بند ناف به عنوان يك منبع غني از سلول‌هاي بنيادي پنجره جديدي به روي درمان‌هاي ترميمي مبتني بر سلول گشوده است. روش‌هاي متنوع زيادي براي جداسازي سلول‌هاي هسته‌دار خون بند ناف به كار گرفته شده است. هيدروكسي اتيل استارچ يك عامل القا سديمانتاسيون گلبول‌هاي قرمز است كه گزارش‌هاي متنوع و گاهاً متضادي درباره غلظت بهينه و توانايي آن در كاهش تعداد گلبول‌هاي قرمز خون وجود دارد. بنابراين مطالعه حاضر به منظور تعيين شرايط و غلظت نسبي بهينه هيدروكسي اتيل استارچ، نيروي نسبي سانتريفوژ، دما و قطر لوله در راندمان جداسازي سلول‌هاي هسته‌دار خون بند ناف انجام پذيرفت. مواد و روش‌ها: خون بند ناف از زنان با زايمان طبيعي جمع‌آوري شد. اثربخشي فرايند جداسازي از طريق شمارش سلولي و برآورد زيستايي سلول‌ها پس از هر مرحله جداسازي در غلظت‌هاي متفاوت هيدروكسي اتيل استارچ، قدرت‌هاي نسبي سانتريفوژ مختلف و دماهاي متفاوت مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج: ميانگين كل درصد سلول‌هاي هسته‌دار جدا شده به ترتيب براي غلظت‌هاي 5/0، 1/1، 8/1 و 5/2 درصد هيدروكسي اتيل استارچ معادل 8/66، 3/73، 1/75، 9/76 و 9/69 درصد بود. بيشترين ميزان سلول‌هاي هسته‌دار در نيروي نسبي سانتريفوژ g50 و در دماي 22 درجه سانتي‌گراد جدا سازي شد. سديمانتاسيون خون آميخته با 5/2 درصد هيدركسي اتيل استارچ در زمان‌هاي 30، 60 و 90 دقيقه به ترتيب منجر به جداسازي 57، 63 و 64 درصد كل سلول‌هاي هسته‌دار خون بند ناف شد. بحث و نتيجه گيري: تعداد كل سلول‌هاي هسته‌دار و گلبول‌هاي قرمز در موفقيت فرايند پيوند خون بند ناف نقش اساسي را ايفا مي‌كند. در اين مطالعه بيشترين ميزان جداسازي سلول‌هاي هسته‌دار 76 درصد با كاهش 90 درصدي گلبول‌هاي قرمز بود كه در شرايط سانتريفوژ با نيروي نسبيg 50 به مدت 10 دقيقه در غلظت 5/2 درصد هيدركسي اتيل استارچ بدست آمد. مطالعات بيشتر به منظور بررسي اثرات ساير عوامل در ميزان سديمانتاسيون گلبول‌هاي قرمز به منظور جداسازي سلول‌هاي هسته‌دار لازم است.

Background and aims: Implication of Umblical cord blood (UCB) as a safe and rich source of stem cell has opened a new window toward treatment of different disease in regenerative medicine. Many various methods have been exploited to purify the UCB in order to increase the percent of nucleated cells (NCs) and decrease the amount of red blood cells (RBCs) which is required for better outcome of transplantation. Hydroxyl ethyl starch (HES) is a sedimentation factor used for RBCs sedimentation and raised some paradox competence in different studies. Thus, in the present study we are aimed to determine the correlation among HES concentration, centrifugation force, temperature, tube diameter and time on the isolation efficiency of NCs and RBCs sedimentation. Materials and methods: UCB was collected from the woman who was undergone normal vaginal delivery. The efficiency of isolation was investigated through enumeration and viability of NCs and RBCs in each step on taken UCB beyound the different concentrations of HES (0.5%, 1.1%, 1.8%, 2.5% and 3%), various relative centrifugation forces (RCFs) of 50g, 100g and 200g for 1, 5 and 10 minutes, diverse 22° C, 10°C and 4°C temperatures and different . In addition UCB sample was incubated in 22 ° for 30, 60, 90, 120, 150 and 180 minutes to test the effect of time on RBCs sedimentation. The height to diameter ratio effect of test tube also was considered. Results: The mean percents of isolated NCs were 66.8±4.1%, 73.3±3.2%, 75.1±3.6%, 76.9±2.9 % and 69.9±4.3% for the concentrations of 0.5 %, 1.1%, 1.8%, 2.5% and 3% respectively. The most NCs were isolated by employing RCF of 50g and temperature of 22 °. Incubation in 30, 60, 90 minutes led to isolation of 57±2.6%, 63±3.7% and 64±3.1% of NCs. Using of tubes with the diameters of 25 mm and 15 mm resulted in 58±6% and 76±3.8 % isolation. Discussion and conclusion: The number of NCs and RBCs in UBC palys pivotal role in transplantation success. The maximum NCs isolation and RBCs sedimentation percent were 76% and 90% respectively under the following condition: RCF of 50g, centrifugation for 10 minutes, and incubation for 60 minutes (p < 0.05) and HES 2.5%. Further studies are required to assess the effect of other factors on isolation rate of NCs and RBCs sedimentation. Key words: umblical cord blood (UBC), Hydroxyl ethyl starch (HES), Nucleated cells (NCs)