بيان و تخليص پروتيين نوتركيب ژن سنتتيك زنجيره HC تتانوتوكسين در سيستم بياني پروكاريوت

Expression and purification of recombinant heavy chain (Hc) of tetanus toxin in prokaryotic expression system

زمينه و هدف: توكسين كلستريديوم تتاني يا تتانواسپاسمين عامل بيماري مهلك كزاز است. امروزه از توكسوييد آن به عنوان واكسن استفاده مي شود. تتانواسپاسمين شامل سه زنجيره L، HN و HC مي باشد. زنجيره HC بخش اتصال دهنده و ايمونوژنيك آن است و به عنوان كانديداي واكسن مطرح مي باشد. هدف از اين مطالعه، طراحي و تهيه ژن صناعي زنجيره HC تتانواسپاسمين، بيان و بهينه سازي آن و تخليص پروتيين نوتركيب حاصل از آن به عنوان كانديداي واكسن است. روش بررسي: در اين مطالعه آزمايشگاهي پس از انجام مطالعات بيوانفورماتيكي و بهينه سازي ترادف ژن HC، سفارش سنتز ژن در وكتور بياني pET28a داده شد. تاييد آن به كمك هضم آنزيمي انجام شد. سپس اين سازه ژني در ميزبان مناسب (E. Coli Bl21DE3) تراريخت گرديد. پس از بيان ژن و تخليص پروتيين نوتركيب، اين پروتيين با كمك وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت. يافته ها: آناليز بيوانفورماتيكي و مولكولي اين ژن، صحت آن را تاييد نمود. باند bp 1356 ژن Hc در ژل آگارز و باند 50 كيلو دالتوني بيان ژن در ژل SDS-PAGE و در غشاي نيترو سلولز (وسترن بلات) مشاهده شد. پروتيين نوتركيب در هر دو شكل محلول و نامحلول (اجسام توده اي شكل) توليد شده بود. اين دو شكل پروتيين با هر دو روش طبيعي و دناتوره به ميزان زيادي تخليص گرديد. نتيجه گيري: با توجه به مزيت هاي پروتيين نوتركيب HC به توكسوييد كزاز به نظر مي آيد پروتيين نوتركيب حاصل مي تواند به عنوان كانديداي واكسن جايگزيني مناسبي براي واكسن كزاز باشد.

Background and aims: Tetanus toxin, the product of Clostridium tetani, is the causative agent of fatal disease tetanus. Nowadays, toxoid form of this toxin used as a vaccine against this disease. Tetanus toxin is composed of three chains: L, HN and Hc. Hc chain is immunogenic and binding domain of toxin. Owing to this fact, Hc is considered as candidate for vaccine. The aim of this study was the design and development Hc gene and its synthesis, expression and expression optimization and purification of recombinant protein as vaccine candidate. Methods: In this laboratory study, after bioinformatics study and gene optimization, the Hc chain gene was ordered to synthase and clone in pET28a vector. The integrity of Hc gene was confirmed by restriction digestion methods. Then, this construct was transformed in E.coli. Subsequently, Gene expression, recombinant protein purification was performed and this protein was confirmed by western blotting technique. Results: The Hc gene was confirmed using bioinformatics and molecular analysis. A 1356 bp band was observed in agarose gel and a 50 kDa band was detected in SDS-PAGE and nitrocellulose membrane (western blot). Recombinant protein was produced in both soluble and insoluble forms (inclusion body). These two forms of proteins were purified in high level by native and denatured methods. Conclusion: Regarding to more advantages of recombinant Hc protein to tetanus toxoid, it seems Hc protein as a suitable vaccine candidate can be replaced with tetanus toxoid vaccine