كشت سلول‌هاي اندوتليال قرنيه انساني در محيط آزمايشگاه با استفاده از مايع آمنيوتيك انساني

Effect of Amniotic Fluid on the Invitro Culture of Human Corneal Endothelial Cells

هدف: ارزيابي اثر مايع آمنيوتيك انساني (Human Amniotic Fluid; HAF) بر روي رشد سلول‌هاي اندوتليال قرنيه انساني (Human Corneal Endothelial Cells; HCECS) و هم‌چنين تعريف محيط كشت براي رشد اين سلول‌ها. روش پژوهش: سلول‌هاي آندوتليوم در محيط 12DMEM-F كه با سرم جنين گاوي 20 درصد غني شده بود كشت داده شدند. پس از اشباع محيط كشت، سلول‌ها مورد درمان با تريپسين قرار گرفته و به محيط كشت حاوي سرم جنين گاوي 20 درصد و مايع آمنيوتيك انساني 10، 20 و 30 درصد منتقل شدند. HAF از زنان باردار در سه ماهه اول بارداري گرفته شد. جهت ارزيابي اثر HAF بر روي رشد و توانايي زيستي سلول، از روش ELISA براي بررسي تكثير و مرگ سلولي استفاده شد. ماهيت سلول‌هاي كشت داده شده در محيط حاوي مايع آمنيوتيك 20 درصد با استفاده از روش‌هاي ايمونوسيتوشيمي و Real time PCR جهت نشانگرهاي ويژه HCECs شامل 67Ki-، Vimentin، Na/K-ATPase، و 1ZO- بررسي شد. يافته‌ها: كشت‌هاي اوليه در محيط حاوي مايع آمنيوتيك منجر به رشد و تكثير سلول‌هاي آندوتليوم در 8/95 درصد موارد گرديد. Real time PCR و ايمونوسيتوشيمي نشان داد كه نشانگرهاي Na/K-ATPase و 1ZO- كه ويژه HCECs مي‌باشند در سلول‌هاي كشت شده در محيط حاوي مايع آمنيوتيك 20 درصد، بيش‌تر از محيط شاهد (حاوي سرم جنين گاوي) بيان مي‌شود. آزمايش ايمونوسيتوشيمي روي سلول‌‌هاي اندوتليال كشت داده شده با HAF 20 درصد، افزايش بيش‌تري را در بيان نشانگرهاي مذكور در مقايسه با محيط‌هاي حاوي غلظت‌هاي 10 درصد و 30 درصد HAF نشان داد. تعداد سلول‌هاي اندوتليال كشت داده شده در HAF 20 درصد كه نشانگرها را بروز مي‌دادند براي شاخص‌هاي Vimentin ،1-ZO ، Na/K-ATPase به ترتيب 98 درصد، 95 درصد، و 100 درصد بود. بيش از 80 درصد سلول‌ها، 67-Ki را بروز مي‌دادند كه نشان مي‌دهد سلول‌ها ظرفيت تكثير خود را حفظ كرده‌اند. ميزان افزايش شاخص‌هاي Vimentin ،1-ZO ،Na/K-ATPase به ترتيب 5 برابر (003/0P=)، 5/3 برابر (001/0P=) و 3 برابر (03/0P=) در محيط حاوي HAF 20 درصد در مقايسه با محيط شاهد بود. Real time PCR افزايش 400 برابري (008/0P=) در بيان ژن Na/K-ATPase و افزايش 500 برابري (01/0P=) در بيان ژن 1-ZO در محيط حاوي HAF 20 درصد در مقايسه با محيط شاهد نشان داد. نتيجه‌گيري: محيط حاوي HAF 20 درصد به طور مشخصي باعث افزايش توانايي تكثير سلول‌هاي آندوتليال قرنيه انسان مي‌شود ولي مشخصات مورفولوژي و آنتي‌ژنيك آن‌ها را حفظ مي‌نمايد. بنابراين HAF مي‌تواند به عنوان يك مكمل غني در مطالعات تكثير HCECs در نظر گرفته شود.

Purpose: To evaluate the effect of human amniotic fluid (HAF) on the growth of human corneal endothelial cells (HCECs) and to establish an in vitro method for the expansion of HCECs. Methods: HCECs were cultured in DMEM-F12 supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS). Confluent monolayer cultures were trypsinized and passaged using 20% FBS- or 10%, 20%, or 30% HAF-containing media. Cell proliferation and cell death ELISA assays were performed to assess the effect of HAF on cell growth and viability. The identity of cells cultured with 20% HAF were studied using immunocytochemistry (ICC) and Real-Time RT-PCR techniques for markers presenting specific characteristics of HCECs including Ki-67, Vimentin, Na/K-ATPase and ZO-1. Results: Primary cultures of HCECs were successfully established under HAF-containing media which led to rapid cell proliferation according to cell proliferation and death ELISA assays. Real-Time PCR and ICC revealed that expression of Na/K-ATPase and ZO-1 in 20% HAF cell cultures was more compared to controls (20% FBS). Conclusion: HAF containing medium exhibited an invaluable stimulatory effect on HCEC growth. It can be regarded as an enriched supplement in HCECs regeneration studies.