بهينه نمودن تشخيص مولكولي كريپتوكوكوس نيوفورمنس با استفاده از كنترل داخلي

Improvement of the Molecular diagnosis of Cryptococcus neoformans using Internal Control (IC)

زمينه: نبود كنترل داخلي در پژوهش‌هاي انجام گرفته در زمينه PCR‌هاي تشخيصي محدوديتي مهم محسوب مي‌گردد. به‌كارگيري تكنيك‌هاي آزمايشگاهي حساس و اختصاصي همچون PCR در تشخيص كريپتوكوكوزيس، ضروري است. روش‌هاي متنوعي براي تشخيص اين قارچ بيماري‌زا وجود دارد. به‌طوركلي روش‌هاي مبتني بر كشت، تكنيك‌هاي وقت‌گير با حساسيت پايين هستند و نيازمند امكانات و تجربه كافي براي تفسير نتايج مي‌باشند و همچنين روش‌هاي رنگ‌آميزي نيزحساسيت لازم را ندارند. در نتيجه روش‌هاي مولكولي از جمله PCR، تكنيك‌هاي مناسب‌تري براي شناسايي هستند. هدف اين مطالعه طراحي و ساخت كنترل داخلي تكثيري پلاسميدي (IAC) جهت شناسايي ممانعت كننده‌ها در آزمايش PCR كريپتوكوكوس نيوفورمنس (C.neo) و كاربردهاي آتي در لابراتوارهاي روتين تشخيصي بوده است. مواد و روش‌ها: در اين بررسي براي ساخت كنترل داخلي، ابتدا پرايمرهاي ويژه آزمايش PCR، بر مبناي هدف ژني 16S rRNA جهت تشخيص مولكولي، بهينه و سپس حساسيت و ويژگي مشخص شد. پرايمرهاي مركب (Composite Primer) براي IAC-C.neo نيز طراحي، تكثير و سپس كلون گرديد. IAC-C.neo تكثير شده در پلاسميد pTZ57R الحاق و در باكتري اشريشيا كلي JM107 ترانسفورم و كلون گرديد. تعداد حداقل IC در هر واكنش PCR با رقيق‌سازي و همچنين طيف پاسخ PCR همراه با IC مورد بررسي قرار گرفت يافته‌ها: اندازه محصول تشخيصي C.neo با پرايمرهاي اختصاصي آن برابر با bp 415 و محصول IAC-C.neo برابر با 661 جفت باز بود، كه از نظر اندازه، اختلاف مطلوب (246 جفت باز) را با هم دارند. تعداد حداقل IC در هر واكنش 1000 عدد تعيين شد. حداقل و حداكثر حساسيت آزمايش PCR همراه با IC براي DNA كريپتوكوكوس نيوفورمنس بين 3 ميليون تا 100 عدد كريپتوكوكوس مشخص گرديد. در آزمايش ويژگي با عوامل مختلف هيچ محصول ناخواسته‌اي مشاهده نشد. نتيجه‌گيري: عليرغم سرعت و دقت بالاي تكنيك PCR، يافته‌هاي منفي و مثبت كاذب كه به‌دلايل مختلف رخ مي‌دهند از مشكلات مهم اين تكنيك جذاب مي‌باشد كه مي‌توانند كارايي آن را كاهش دهند. استفاده از يك كنترل داخلي در تشخيص مولكولي كريپتوكوكوس نيوفورمنس، اين خطاها را شناسايي مي‌نمايد.

Background: Lacking of internal control in majority of the PCR realated searchesis one of the most important items yet. Using sensitive and specialized laboratory techniques such as PCR is necessary to cryptococosis diagnosis. Different methods to detect this pathogen exist. Generally, culturing based methods are time consuming and have low sensitivity and need enough experience and equipments to data analyzing. Further painting based methods have no sufficient sensitivity as well. As a result, molecular techniques such as PCR are more appropriate to diagnosis purposes, but different data gathered from non standard tests supposed to be one of the deficiencies of this powerful molecular technique. This aim of this study was to design and produce the plasmid amplification internal control (IAC) to identify the restrictors in Cryptococcus neoformans PCR test and its future applications in the routine diagnostic laboratories. Materials and methods: In this study to produce internal control, first the special PCR primers based on Gene target 16SrRNA for optimized molecular detection and then sensitivity and character were identified. Then, the composite primers for IAC C. neoformans was designed, replicated and clonized as well. The replicated IAC C. neoformans was attached to pTZ57R and transformed and colonized in E.coli JM107. The minimum IC number of each PCR reaction was studied using dilution and PCR reaction spectrum with IC. Results: The size of C. neoformans diagnostic product with its special primers was 415 bp and IAC C. neoformans amplicon is 661 bp, which have desired deference in the size (246 bp). The minimum IC number was identified 1000 in each reaction. The min/max sensitivity of PCR test with IC for C. neoformans DNA was identified between 100 particle to 3 million yeasts. There was no unwanted product in the character test with different agents. Conclusion: In spite of high rate and exclusivity of PCR technique, one of the main difficulties of this exacting method is the false positive and negative results which occur because of different reasons which may led to decrease its performance. Using an internal control for molecular diagnosis of Cryptococcus neoformans as inside controlling systemcan detect these errors.