آنتاگونيست رسپتور اينترلوكين-1 انساني: كلونينگ، بيان و بهينه سازي در ميزبان E.coli

Human Interleukine-1 receptor antagonist: Cloning, Expression and Optimization in E.coli Host

مقدمه و هدف: آنتاگونيست رسپتور IL-1 (IL-1Ra) يك سايتوكاين ضد التهابي قوي است كه باعث محدود كردن اثرات التهابي مربوط به اينترلوكين-1 ((IL-1 مي شود. بعلت تشابه ساختماني با IL-1، IL-1Ra به طور رقابتي به رسپتور IL-1 متصل مي شود ولي هيچ سيگنالي را القا نمي كند. بنابراين در درمان افراد مبتلا به بيماري هاي التهابي نظير آرتريت روماتوييد بكار مي رود. هدف از مطالعه حاضر كلون كردن، بيان و بهينه سازي بيان اين پروتيين در E. coli مي باشد. روش كار: دراين مطالعه تجربي قطعه ي ژني سنتزي مربوط به IL-1Ra به وسيله PCR تكثير داده شد. پس از برش دو آنزيمي، اين قطعه در وكتور بياني pET28a كلون گرديد. بيان ژن مورد نظر ابتدا در سطح mRNA به روش RT-PCR و سپس در سطح پروتيين به روش SDS-PAGE مورد برسي قرار گرفت و براي تاييد پروتيين بيان شده از وسترن بلات استفاده گرديد. بهينه سازي بيان نيز در غلظت هاي مختلف IPTG و مدت زمان هاي مختلف بعد از القا صورت گرفت. نتايج: به كمك روش كلني-PCR و هضم دو آنزيمي، كلون شدن قطعه ي ژني مورد نظر در وكتور بياني pET28a مشخص شد. رونويسي از ژن كلون شده و بيان بالاي پروتيين نوتركيب به ترتيب به روش RT-PCR و SDS-PAGE مشاهده شد. نتيجه ي حاصل از الكتروفورز پروتيين نيز با روش وسترن بلات تاييد گرديد. ميزان بيان در غلظت هاي مختلف القا كننده و مدت زمان پس از القا بهينه سازي گرديد. نتيجه نهايي: نتايج حاصل از مطالعه نشان دهنده ي بيان بالاي اين پروتيين در ميزبان E.coli به وسيله وكتور بياني pET28a بود. اين مطالعه هم چنين نشان داد رابطه مستقيمي با افزايش بيان و مدت زمان برداشت سلول ها پس از القا وجود دارد، لذا القا با غلظت 1 ميلي مولار IPTG به مدت يك شب براي بيان بالاي پروتيين پيشنهاد مي گردد.

Introduction & Objective: Interleukine-1 receptor antagonist (IL-1RA) is a powerful anti-inflammatory cytokine which limits the biological effects of IL-1. Due to structural similarity between IL-1 and its antagonist, IL-1RA competitively binds to IL-1 receptor which leads to no signal transduction. Therefore , it is applied in the treatment of patients with inflammatory diseases such as Rheumatoid Arthritis. The aim of this study is cloning, expression and op-timization of IL-1RA in E. coli. Materials & Methods: In this experimental study synthetically prepared cDNA was amplified by PCR. After double digestion with NdeI and XhoI restriction enzymes, this gene was cloned in pET28a expression vector. Expression of desired gene was analyzed at RNA level by RT-PCR and at protein level by SDS-PAGE and followed by western blot to confirm SDS-PAGE results. Optimization of recombinant protein expression was performed in dif-ferent IPTG concentrations and harvesting times after induction. Results: The presence of gene in pET28a was determined by colony-PCR and confirmed by restriction digestion. Transcription of cloned gene and expression of high yield recombinant protein were shown by RT-PCR and SDS-PAGE, respectively. The result of SDS-PAGE was confirmed by western blot. Expression was optimized in different induction time and IPTG concentrations Conclusion: The result of this study demonstrated expression of this recombinant protein at high level in E.coli system by pET28a expression vector. This study also showed a direct as-sociation between the increased level of expression and time of induction . Therefore, an overnight induction time with 0.1 mM IPTG concentration is recommended for a high level expression. (Sci J Hamadan Univ Med Sci 2014; 21 (2):145-151)