اولين گزارش از Diplodia malorum Fuckel عامل بيماري شانكر درختان سيب در ايران*

FIRST REPORT OF Diplodia malorum Fuckel THE CAUSAL AGENT OF CANKER DISEASE OF APPLE TREES IN IRAN

در تابستان سال 1388 بيماري خشكيدگي شاخه و شانكر تنه درختان سيب (Malus domestica Borkh.) رقم گلدن در باغات استان آذربايجان غربي ديده شد. بيماري در اثر تنش هاي محيطي مثل خشك سالي و سرمازدگي گسترش يافته، پوست و سيستم آوندي درخت در محل آلودگي كاملا تيره مي شود و محل شانكر در تنه اصلي و شاخه‌ها پوسته پوسته مي گردد. جهت جداسازي، بافت هاي آلوده و مشكوك به بيماري به مدت 3 دقيقه در اتانول 70 درصد ضد عفوني سطحي گرديده و 3 مرتبه با آب مقطر سترون شسته شدند. قطعات پس از خشك شدن بين كاغذ صافي سترون، روي محيط كشت PDA منتقل و در دماي 25 درجه سلسيوس و تاريكي قرار داده شدند. از قارچ‌هاي رشد كرده در حاشيه بافت‌هاي گياهي، قطعاتي برداشته شده و به محيط كشت آب آگار 2 درصد منتقل و عمل خالص سازي به روش كشت نوك ريسه انجام گرفت. براي القاي تشكيل اندام‌هاي باردهي غير جنسي، از روش سوزن كاج قرار گرفته روي محيط كشت آب آگار 2 درصد استفاده گرديد. تشتك‌هاي مايه‌زني شده به مدت 4 هفته در دماي 25 درجه سلسيوس و در زير نور نزديك ماورا بنفش (near-UV) و با دوره نوري 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريكي جهت توليد پيكنيديوم‌ها نگهداري شدند (Pavlic et al. 2008). براي شناسايي قارچ‌هاي رشد يافته، معيارهاي مختلف ماكروسكوپي از قبيل رنگ و خصوصيات ظاهري رشدي پرگنه و مشخصات ميكروسكوپي از قبيل رنگ، شكل و ابعاد كنيديوم، سلول‌هاي كنيدي‌زا و پيكنيديوم مورد مطالعه قرار گرفتند. براي تاييد شناسايي مورفولوژيك، بخش ITS در يكي از جدايه هاي منتخب، با استفاده از آغازگر هاي ITS1 و NL-4 تكثير و ترادف يابي گرديد. بر اساس مطالعات مورفولوژيك و ترادف يابي بخش ITS ، گونه Diplodia malorum شناسايي شد. مشخصات توصيفي گونه به شرح زير است: بافت پرگنه در ابتدا سفيد رنگ، ولي بعد از گذشت دو هفته به رنگ زيتوني نخودي تا زيتوني متمايل به سبز تغيير يافته و در نهايت بعد از سه هفته كاملاً سياه مي شود. كنيديوماتاها به صورت پيكنيديومي، به قطر تقريبي 600 × 500 ميكرومتر، به طور منفرد يا در دسته‌هاي چندتايي به شكل گرد تا تقريباً مخروطي، به رنگ قهوه‌اي تيره تا سياه و فرورفته در بافت و در هنگام بلوغ كمي شكوفا مي‌باشند. سلول‌هاي كنيدي‌زا بي‌رنگ، صاف، استوانه‌اي شكل، در قسمت پايه متورم و به ابعاد 16- 7 × 5- 5/2 ميكرومتر هستند. كنيدي‌زايي در يك سطح با قطور شدگي حاشيه‌اي (Priclinal) و يا به صورت percurrent و داراي 2 يا 3 حلقه مي‌باشد. كنيدي‌ها با ديواره ضخيم، با سطح بيروني صاف و سطح دروني زگيل‌دار، تقريباً بيضي كشيده تا استوانه اي، در هر دو انتها گرد، ابتدا بي رنگ و يك سلولي بوده و به مدت طولاني در داخل پيكنيديوم بي‌رنگ باقي مي مانند ولي بعد از خروج از پيكنيديوم، به رنگ قهوه‌اي تيره تغيير مي يابند و داراي يك ديواره عرضي (ندرتا 2 ديواره عرضي) و به ابعاد 16-11 × 34-5/19 ميكرومتر مي‌باشند (شكل 1). جستجوي بلاست توالي به‌دست آمده با توالي هاي موجود در بانك ژن شباهت 100 درصدي آن را با جدايه هاي گونه Diplodia malorum تاييد نمود (Phillips et al. 2012). آزمون اثبات بيماري زايي، با تلقيح جدايه‌ها روي نهال‌هاي دو ساله و هم چنين ميوه سيب رقم گلدن در قالب طرح كاملاً تصادفي به همراه تيمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت 8 هفته، تمام نهال هاي تلقيح شده توسط جدايه هاي قارچي علايم شانكر، سياه و خشك شدن پوست در اطراف محل تلقيح شده را نشان دادند، در صورتي كه در تيمار شاهد، هيچ‌گونه سياه شدگي و يا خشك شدن پوست مشاهده نگرديد و بافت كالوز در اطراف زخم ناشي از برداشتن حلقه تشكيل و رشد عادي نهال‌ها ادامه يافت. در مورد ميوه ها، مطالعات بيماري زايي نشان داد كه بعد از گذشت 6 روز، در اطراف محل تلقيح، علايم پوسيدگي قهوه اي تيره با حاشيه كاملاً مشخص و متمايز از بافت سالم ايجاد شد و در برش عمودي از محل تلقيح، پيشرفت پوسيدگي به داخل ميوه به طور مشخصي مشاهده گرديد، در صورتي‌كه در تيمار شاهد هيچ گونه علايم پوسيدگي يا تغيير رنگ ايجاد نگرديد (شكل 2). از بافت‌هاي تازه آلوده شده و داراي نشانه‌هاي سياه شدگي پوست در نهال ها و ميوه ها، بعد از عمل ضد عفوني سطحي، عمل جداسازي و شناسايي قارچ مجددا انجام گرفت و به اين ترتيب اصول كخ اثبات شد. نتايج تجزيه واريانس آزمون اثبات بيماري‌زايي نشان داد كه تمام جدايه‌هاي مورد مطالعه، روي نهال ها و ميوه هاي سيب بيماري زا بوده و نسبت به تيمار شاهد تفاوت معني‌داري نشان دادند. بر اساس بررسي منابع، اين اولين گزارش از وجود و تعيين بيماري زايي گونه Diplodia malorum مرتبط با شانكر درختان سيب در ايران مي باشد.

In summer of 2009, a disease with symptoms such as stem and trunk cankers were seen in apple Golden Delicious cultivars trees in west Azerbaijan orchards. The disease was in progress due to environmental stresses such as drought and frostbite. Bark and vascular system of the tree was darkened at the site of infection and cankers were scaling on main trunk and branches. To isolation of the fungi, infected tissues were surface sterilized for 3 min in 70% ethanol and were washed 3 times with sterile distilled water. Pieces were taken from sterilized tissues and were transferred to PDA, and then were kept at 25 °C, in the dark. The growing fungi were purified by hyphal tip method. To induce the formation of asexual fruiting bodies, the method of using pine needles were used. Inoculated Petri plates were kept for 4 weeks at 25 °C under near-ultraviolet light (near-UV) with 12:12h photoperiod to produce the pycnidia (Pavlic et al. 2008). Different macroscopic and microscopic characters such as color and growth characteristics of colony, color, shape and dimensions of conidium, conidiogenous cell and pycnidium were studied. Also, the ITS region of one selected isolate was amplified and sequenced. Based on morphological and ITS sequence analysis, Diplodia malorum was identified. Descriptive characters of the species are as: Colony at first white, after two weeks turned to olive buff to olive greenish and finally after three weeks became dark. Conidiomata pycnidial, 600 × 500 mm in diameter, solitry or aggregated, spherical to oblong, dark brown to black, immersed, partially erumpent when mature. Conidiogenous cells hyaline, smooth, cylindrical, swollen at the base, 7 - 16 × 2.5 - 5 µm, proliferating at the same level to produce periclinal thickening, or proliferating percurrently, giving rise to 2-3 annelations. Conidia aseptate, thick-walled, smooth outer surface and verruculose inner surface, oblong to cylindrical with broadly rounded ends, hyaline, becoming dark brown and 1-septate after release from the pycnidium (rarely two septum), 17.5-34 × 11-16 µm. The results of Blast search showed high similarity (100 percent) of the studied isolate with the isolates belong to Diplodia malorum deposited in Gene bank(Phillips et al. 2012). The pathogenicity tests were carried out on potted 2 years old seedlings and fruits of apple Golden cultivar based on completely randomized design. After eight weeks post inoculation, symptoms of bark darkening and canker were seen in inoculated areas. In fruits, six days after inoculation the brown rot symptoms were seen in the inoculated area which was progressed into the fruit flesh. In the controls, no symptoms were developed. Reisolation and identification of the inoculated fungi were done from the newly infected tissues and fulfilled Kochʹs postulates. To our knowledge, this is the first report of isolation and pathogenicity confirmation of Diplodia malorum from apples in Iran.