بهينه سازي آنتي ژن T براي طراحي و ساخت پلاسميد اپي زومال بر مبناي آنتي ژن T ويروس سيمين 40 موتانت

Optimizing of Large T Antigen for Designing and Constructing Episomal Plasmid Based on Mutated Large T Antigen Simian Virus 40

زمينه و هدف: ژن درماني و تجويز پروتيين هاي نوتركيب از روش هاي معمول در درمان بيماري هاي ژنتيكي مي باشد. اما موانع موجود در اين دو روش مانند تجويز محدود پلاسميد حاوي ژن مورد نظر يا وارد شدن تصادفي ژن انتقالي در ژنوم در مورد ژن درماني و ميزان بيان كم پروتيين در مورد توليد پروتيين هاي نوتركيب محققين را بر آن داشته است پلاسميد اپي زومالي طراحي كنند كه بوسيله پروتيين هاي ويروسي در تعداد نسخه بالا در سلول هاي يوكاريوتي باقي مانده و پروتيين مورد نظر را به ميزان مطلوبي بيان نمايند. هدف از اين مطالعه طراحي و ساخت پلاسميدي با ژن جهش يافته آنتي ژن T ويروس سيمين 40 جهت دستيابي به ناقلي ايمن با همانندسازي بالا است. روش كار: براي ايجاد جهش مناسب در آنتي ژن T موتانت از نرم افزار مودلر جهت بررسي استفاده شد و در نتيجه جهش مناسب انتخاب شد. جهش هدف در توالي نوكليوتيدي ژن آنتي ژن T موتانت با روش واكنش زنجيره اي پليمراز ايجاد شد. و ژن جهش يافته آنتي ژن T درپلاسميد EGFP-2ESIR كلون شد. تمام كلونها با روش واكنش زنجيره اي پليمراز، هضم آنزيمي و تعيين توالي بررسي شدند. خط هاي سلولي كليه جنيني انسان 293 و تخمدان هامستر چيني با سازه نهايي ترانسفكت و با ميكروسكوپ فلورسانت به مدت چهل روز مشاهده شدند. و در نهايت از رده هاي سلولي فوق پلاسميد و DNA ژنوميك تخليص گرديد و بر روي آنها واكنش زنجيره اي پليمرازهاي همپوشان به منظور اثبات حلقوي بودن پلاسميدها انجام شد. يافته ها: اين پلاسميد با جهش ايجاد شده در ژن جهش يافته آنتي ژن T ويروس سيمين40 توانست در سلولهاي يوكاريوتي با توانايي بالا همانندسازي كند و مي توان از آن در پروسه هاي ژن درماني و توليد پروتيين هاي نوتركيب استفاده كرد. نتيجه گيري: هر سه روش واكنش زنجيره اي پليمراز، هضم آنزيمي و تعيين توالي تاييد كننده صحت انجام سازه بودند و ترانسفكشن سلولهاي خط سلولي كليه جنيني انسان 293 و تخمدان هامستر چيني نشانگر همانندسازي پلاسميد در سلولهاي فوق بود.

Background & Objective: Gene therapy and administration of recombinant protein are common approach in treatment of genetic disorders. But many obstacles including frequent administration of desired gene, random integration into the host genome and low expression of protein encourage scientists to design an episome which remains in high copy number in eukaryotic cells and produces desired protein in suitable manner by viral proteins. The aim of this study is designing and construction of a plasmid containing mutated large T antigen of SV40 to develop a safe vector with high replication. Methods: Suitable mutant for creating large T antigen was analyzed by MODELLER software and finally appropriate structures were selected. Target mutation was created in the nucleotide sequence of large T antigen by PCR method. Mutated large T antigen gene was cloned in to the IRES2-EGFP. All clones were analyzed by PCR, restriction analysis and sequencing. HEK293 and CHO cell lines were transfected by final construct and transfected cells were observed by fluorescent microscope for 40 days. Plasmid and genomic DNA were extracted from remained cells and overlap PCRs performed on them to confirm their circularity. Result: This plasmid, containing a mutated large T antigen of SV40, can be replicated in eukaryotic cells and then can be used in gene therapy and recombinant protein production with high safety. Conclusion: The results of PCR, restriction analysis and sequencing confirm the authenticity of construct. The transfection of HEK293 and CHO cell lines showed replication of constructed plasmid in them.