افزايش توليد آنتي‌بيوتيك كلاولانيك‏اسيد با ايجاد گونه‌هاي استرپتومايسس كلاولي‌جروس تراريخت واجد ژن claR

Increase of Clavulanic acid production by using recombinant Streptomyces clavuligerus strain including claR gene

مقدمه: كلاولانيك‏اسيد از جمله آنتي‌بيوتيك‌هاي مهار كننده‌ي B لاكتاماز بوده كه توسط استرپتومايسس كلاولي‌جروس توليد‌ مي‏شود. كلاولانيك‏اسيد در تركيب با ساير آنتي‌بيوتيك‌هاي قوي و حساس به B لاكتاماز مورد استفاده باليني قرار مي‏گيرد. ژن‌ CalR از جمله ژن‌هايي بوده كه نقش مهمي در تنظيم توليد كلاولانيك‏اسيد ايفا نموده و به منظور بيان ژن‌هاي اواخر مسير بيوسنتز كلاولانيك‏اسيد مورد نياز است‏‏. مواد و روش‏‏ها: كانسترك نوتركيب pMTclaR حاوي ژن تنظيمي claR از دانشگاه اصفهان تهيه و به منظور استفاده، از سويه‌ استرپتومايسس ليويدنس با استفاده از روش ليز قليايي استخراج شد. به منظور انجام ترانسفورماسيون پروتوپلاست از باكتري استرپتومايسس كلاولي‌جروس تهيه و در مرحله‌ بعد با استفاده از پلي‌اتيلن‌‌گلايكول در سويه‌ استرپتومايسس كلاولي‌جروس ترانسفورم شد. با استفاده از استخراج پلاسميد و انجام PCR ترانسفورماسيون تاييد شد. در نهايت به منظور بررسي نحوه‌ تاثير ژن claR اضافه شده از روش بايواسي استفاده شد. نتايج: كلوني‏‌هاي گچي حاصل از رشد استرپتومايسس كلاولي‌جروس ترانسفورم شده بر روي محيط GYME حاوي آنتي‌بيوتيك مشاهده شد كه تاييد انجام ترانسفورماسيون است. از سويه‌ ترانسفورم شده پلاسميد استخراج و ساختار آن توسط ژل الكتروفورز تاييد شد. با استفاده از پلاسميد استخراج شده و پرايمرهاي اختصاصي claR واكنش PCR انجام و باند 1334 جفت‌بازي مشاهده شد. در نهايت با انجام روش بايواسي و مشاهده‌ي هاله‌ عدم رشد در نمونه‌ ترانسفورم شده و مقايسه‌ آن با نمونه‌ كنترل مشخص شد كه حضور پلاسميد نوتركيب سبب افزايش 3/3 برابري توليد كلاولانيك‏اسيد در سويه‌ استرپتومايسس كلاولي‌جروس شده است. بحث و نتيجه‏گيري: در مطالعه‌ حاضر، با انتقال پلاسميد نوتركيب حاوي ژنclaR ميزان توليد آنتي‌بيوتيك كلاولانيك‏اسيد تا 5/2 برابر افزايش يافت. با توجه به اهميت دارويي كلاولانيك‏اسيد ايجاد سويه‌هايي كه توانايي توليد بيشتر كلاولانيك‏اسيد را داشته باشند مي‌توانند به بومي‌سازي توليد آنتي‌بيوتيك كلاولانيك‏اسيد با صرفه‌ اقتصادي بيشتر درمقياس صنعتي كمك شاياني نمايد.

Introduction: Clavulanic acid is a major B-lactam antibiotic which is produced by Streptomyces clavuligerus. Clavulanic acid is used in combination of strong but sensitive to B-lactamase antibiotics. The claR gene has an important role in regulation of clavulanic acid production and is needed for the expression of the genes in final step of clavulanic acid biosynthesis. Materials and methods: The recombinant construct pMTclaR which contains claR gene is obtained from Isfahan University and plasmid extraction was done from Streptomyces lividans for next steps. The Streptomyces clavuligerus protoplast was prepared and transformation was done by using polyethylene glycol. Transformation was confirmed by plasmid extraction and PCR. Finally, bioassay method was used to survey the effect of extra copy of claR on clavulanic acid production. Results: The typical chalky white colony of Streptomyces clavuligerus was seen on GYME plates containing thiostrepton antibiotic. Plasmid extraction was initially carried out. Furthermore, PCR reaction was done by claR specific primers and the 1334 bp band which was belonging to claR was detected. Finally, the bioassay was done and the diameters of zone of inhibition in control and sample were compared. The results of the bioassay show that amplification of the claR gene in multicopy plasmids resulted in a 2.5 fold increase in clavulanic acid production. Discussion and conclusion: In this study the 3.3 fold increase in clavulanic acid production was obtained by using an expression vector containing claR. According to the clinical use of clavulanic acid, production of bacterial strains which are able to produce high level of antibiotic can help significantly in customization of antibiotic production. Key words: Streptomyces clavuligerus, Clavulanic acid, Bioassay, pMTclaR plasmid, ClaR gene