بررسي بيان ژن و خالص سازي زير واحدهاي S100 A8 , S100 A9 كالپروتكتين و بررسي ساختارآنها

Evaluating Gene Expression, Purification and Structural Characterization of the Calprotectin Subunits of S100 A8and S100 A9

زمينه و هدف: كالپروتكتين، S100 A8 و S100 A9 در فرآيندهاي مهمي نظير پيام رساني و تنظيم پاسخ هاي التهابي نقش دارند. در اين مطالعه، بيان S100 A8 وS100 A9 بصورت نوتركيب، خالص سازي و بررسي ساختار آنها انجام گرديد. روش كار: در اين مطالعه تجربي از pET15b به عنوان حامل توالي كد كننده ژنهاي S100 A8, S100 A9 انساني و از E.coli BL21(DE3) به عنوان ميزبان استفاده گرديد. بيان ژن و فرآيند خالص سازي از طريق SDS-PAGE مورد ارزيابي قرارگرفت. خالص سازي پروتيينها با استفاده از رزين Ni-NTA و بر اساس ميل تركيبي آن به His-Tag پروتيين هاي نوتركيب انجام گرفت. ساختار سوم پروتيين ها با طيف سنج فلورسانس بررسي شد. يافته ها: زير واحدهاي مذكور 4-3 ساعت بعد از القا و دماي 37 درجه سانتي گراد بيان بالايي را نشان دادند. درصد بالايي از پروتيين S100A9 در فاز اينكلوژن بادي نشان داده شد، در حاليكه زير واحد S100A8 عمدتا بصورت محلول بيان گرديد. S100A8 و S100A9 در غلظت mM 100 ايميدازول خالص سازي گرديد. در بررسي طيف سنجي نشان داده شد كه اسيد آمينه تريپتوفان در ساختار هاي داخلي قرار گرفته و كمتر در معرض محيط آبي است. نتيجه گيري: در اين مطالعه زير واحدهاي S100A8 و S100A9 بصورت نوتركيب بيان شده و تخليص گرديد. همچنين، ساختار آنها مورد تاييد قرار گرفت.

Background & objectives: Calprotectin, S100A8 and S100A9 are involved in important processes including cell signaling and regulation of inflammatory responses. In this study, recombinant expression, purification and structural characterization of S100A8 and S100A9 were accomplished. Methods: In this experimental study, pET15b was used as vector of human S100A8 and S100A9 coding sequences, hosted by E.coli BL21 (DE3). Gene expression and purification attempts were evaluated using SDS-PAGE. Protein purification was accomplished using Ni-NTA resin based on its affinity for His-tag present on recombinant proteins. Tertiary structure of proteins were evaluated using spectrofluorimetry. Results: The subunits were over expressed 3-4 hours following induction at 37 °C. S100A9 was expressed mainly as inclusion body while S100A8 was found to be expressed mainly as a soluble protein. Purification of S100A8 and S100A9 was achieved at 100 mM imidazole. Spectroscopic studies showed that the amino acid tryptophan is in the internal structures and is less exposed to the aqueous environment. Conclusion: In this study, a recombinant S100A8 and S100A9 subunits were expressed and purified and also their structures were confirmed.