توليد فرم نوتركيب ايزوفرم تيپ 1 متالوتيونين برنج (OsMTI-1b) در باكتري اشريشياكلي و بررسي قابليت اتصال آن به فلز نيكل

Heterologous Expression of a Rice Metallothionein type 1 Isoform in Esherichia coli and Study of It’s Binding Ability to Nickel

گياهان به مكانيسم هاي سلولي مختلفي در مقابله با اثر سمي فلزات سنگين مجهز شده اند. يكي از مهم ترين اين مكانيسم‌‌ها، توليد پروتيين‌ها و پپتيدهاي متصل شونده به فلزات، مانند متالوتيونين‌ها (MT) مي‌باشد. متالوتيونين‌ها، گروهي از پروتيين‌ها با وزن مولكولي كم و غني از آمينواسيدهاي سيستيين هستند كه داراي ظرفيت بالاي اتصال به فلزات مي باشند. در اين تحقيق توالي‌ كد كننده‌ي ايزوفرمOsMTI-1b از گياه برنج، به عنوان گياه مدل در بين تك لپه‌اي‌ها، در ناقل بياني pET41a همسانه‌سازي و به ميزبان بياني E. coli سويه‌ي Rosetta (DE3) منتقل شد. پس از القا محيط كشت توسط IPTG، ميزان مناسبي از پروتيين هاي نوتركيب در فاز محلول توليد و با استفاده از روش كروماتوگرافي جذبي خالص سازي شد. سلول‌‌‌‌‌هاي باكتري بيان‌كننده‌ي پروتيين‌هاي نوتركيب در محيط LB حاوي نمك NiCl2 رشد داده شدند و منحني رشد آن‌ها در مقايسه با شاهد ترسيم شد. مقدار كاهش فلز نيكل در محيط كشت و تجمع آن‌ها در رسوب باكتريايي توسط دستگاه طيف سنجي پلاسماي جفت شده‌ي القايي (ICP-AES) به دست آمد. بر اساس نتايج مشخص گرديد بيان ايزوفرمOsMTI-1b از طريق افزايش تجمع درون سلولي فلز نيكل موجب افزايش تحمل باكتري E. coli به اين فلز مي گردد. همچنين، بررسي الگوي جذب نور و واكنش DTNB با پروتيين هاي انكوبه شده با فلز نيكل در شرايط اين ويترو، تشكيل دستجات فلز/تيول در پروتيين نوتركيب GST-OsMTI-1b را اثبات نمود. يافته هاي پژوهش حاضر مي تواند منعكس كننده نقش احتمالي ايزوفرمOsMTI-1b در تحمل گياه برنج به تنش فلزات سنگين باشد.

Plants process several potential cellular mechanisms for detoxification of heavy metals. One of the most important mechanisms is synthesis of metal binding peptides and proteins such as metallothioneins (MTs). MTs are low molecular weight and cystein-rich proteins that can bind metal ions through their thiol groups. In this study the coding sequence of gene encoding OsMTI-1b isoforms from rice (), was cloned in pET41a and transferred into expression host, Escherichia coli strain Rosetta (DE3). After induction with IPTG, considerable amount of recombinant proteins was produced in the soluble fraction of the E.coli transforman. Recombinant proteins were purified using affinity chromatography. The tolerance of cells expressing recombinant proteins toward Ni, were compared to control by plotting their growth curve in addition to determination of the amount of accumulated Ni ions in bacterial cells and culture medium using inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES). According to the results, over-expression of OsMTI-1b isoform increased the tolerance of E. coli cells to Ni through accumulation of more metal ions inside cells. Furthermore, the UV absorption spectra and competitive reactions of in vitro Ni-incubated proteins with 5-5ʹ dithiobis (2-nitrobenzoic) acid (DTNB) revealed that GST-OsMTI-1b protein is able to form Ni-thiolate clusters. Taken together, these data indicate that OsMTI-1b isoform may be involved in protection of rice cells against heavy metal toxicity.