اثرات پارامترهاي مختلف بر روي كيفيت نتايج حاصل از تكنيك cDNA-AFLP در مطالعه

Effects of various parameters influencing the quality of results in a cDNA-AFLP technique used for transcriptom analysis of potato

آناليز هاي ترانسكريپتوم در ايجاد اطلاعات و درك كافي از سيستم هاي واكنشي گياهان در برابر عوامل زيستي و غير زيستي بسيار كارآمد هستند. cDNA-AFLP به عنوان روشي مناسب علاوه بر تكرار پذيري بالا، نياز به اطلاعات اوليه در مورد توالي ژن ها ندارد. البته عوامل متعددي در حساسيت، دقت و تكرار پذيري آن موثر هستند كه توجه به اين عوامل مي تواند باعث افزايش كيفيت ارزيابي ها و دستيابي به اطلاعات صحيح گردد. در تحقيق حاضر cDNA-AFLP براي آناليز واكنش گياه سيب زميني در برابر استرس ناشي از باكتري بيماريزاي Ralstonia solanacearum در شرايط in vitro بهينه سازي گرديد. در اين راستا پارامترهاي مختلف و اثر تعامل آنها با يكديگر در افزايش حساسيت و تكرار پذيري اين روش بررسي شد. نتايج نشان داد روش استخراج RNA و استفاده از mRNA از فاكتور هاي تاثير گذار در موفقيت آزمون cDNA-AFLP است به طوري كه RNA هاي استخراج شده با استفاده از روش مبتني بر ستون از يكنواختي و كيفيت بالاتري برخوردار هستند و استخراج mRNA علاوه بر حذف RNA هاي ريبوزومي، در كاهش ممانعت كننده ها و اجراي صحيح ساير مراحل آزمون تاثير گذار است. همچنين بهينه سازي فاكتورهايي از قبيل رقت مناسب محصول پيش تكثير كه به عنوان الگو در مرحله تكثير انتخابي استفاده مي شود، تعداد سيكل PCR در مرحله پيش تكثير، غلظت مناسب MgCl2 و Taq DNA Polymerase در مراحل پيش تكثير و تكثير انتخابي، نقش تعيين كننده اي بر روي تعداد و غلظت قطعات cDNA تكثير شده و وضوح آن بر روي ژل دارد.

Transcriptome analysis reveals novel insights in the plant responses against biotic and abiotic stresses. cDNA-AFLP is appropriate and repeatable method for genome wide expression analysis when genomic information is limited. Although several factors may affect sensitivity, accuracy and repeatability of cDNA-AFLP technique so attention to these factors increases quality of results. In this study cDNA-AFLP technique was optimized for analysis of potato against Ralstonia solanacearum under in vitro conditions through examining various factors and their interactions, that affecting the results of such analysis. Results showed that RNA extraction method and the use of mRNA has large effects on the reliability of results. RNAs extracted based on using a purification column were monotonous. Ribosomal RNA and inhibitors alleviated by mRNA extraction, Also optimization of factors such as concentrations of template RNA, Mgcl2 and Taq DNA polymerase, in pre and selective amplification has significant effects on number, clarity and concentration of amplificated cDNA fragments