بهينه‌سازي روش فنول كلروفرم سيليكا براي استخراج DNA از نمونه استخوان‌هاي قديمي

Optimization of the Phenol -Chloroform Silica DNA Extraction Method in Ancient Bones DNA Extraction

مقدمه: استخراج DNA از نمونه استخوان‌هاي قديمي همواره با مشكلات زيادي همراه است. روش فنول كلروفرم سيليكا يكي از روش‌هايي است كه به‌طور معمول براي اين منظور استفاده مي‌شود. در اين مطالعه هدف بررسي و بهينه‌سازي مراحل اين روش است. مواد و روش‌ها: DNA 62 نمونه استخوان (داراي عمر 3 تا 11 سال) ابتدا با روش فنول كلروفرم معمولي و سپس با تغيير بعضي پارامترها استخراج شد. DNA حاصل در هشت منطقه STR به نام‌هاي CD4, vWA, LPL, D5S818, D16S539, D13S317, F13, FES توسط واكنش PCR تكثير شد و نتايج حاصل برروي ژل اكريلاميد مقايسه شد. نتايج: ميانگين بازدهي واكنش PCR، براي روش جديد و روش معمولي در هشت منطقه پلي‌مورفيك ذكر شده به‌ترتيب 75%، 78%، 81%، 76%، 85%، 71%، 89%، 86%و 64%، 39%، 70%، 49%، 68%، 76%، 71%، 28% بود. متوسط ميزان DNA حاصل از روش بهينه شده (در غلظت µl35 ذرات سيليكا) و معمولي به‌ترتيب برابر µg/ml 5/267 با خلوص 12/1 و µg/ml 76/192 با خلوص 84/0 بود. نتيجه‌گيري: طبق يافته‌هاي اين مطالعه به‌نظر مي‌رسد تيمار طولاني‌تر با EDTA يكي از عوامل موثر حذف بهتر كلسيم باشد و همچنين غلظت مناسب ذرات محلول سيليكا مي‌تواند تاثير مهمي در حذف مهار‌كننده‌هاي PCR داشته باشد.

Introduction: DNA extraction from the ancient bones tissues is currently very difficult. Phenol chloroform silica method is one of the methods currently used for this aim. The purpose of this study was to optimize the assessment method. Methods: DNA of 62 bone tissues (average 3-11 years) was first extracted with phenol chloroform silica methods and then with changing of some parameters of the methods the extracted DNA was amplified in eight polymorphisms area including FES, F13, D13S317, D16, D5S818, vWA and CD4. Results from samples gained by two methods were compared in acrylamide gel. Results: The average of PCR yield for new method and common method in eight polymorphism regions was 75%, 78%, 81%, 76%, 85%, 71%, 89%, 86% and 64%, 39%, 70%, 49%, 68%, 76%, 71% and 28% respectively. The average of DNA in optimized (in 35l silica density) and common method were 267.5 µg/ml with 1.12 purity and 192.76 g/ml with 0.84 purity respectively. Conclusions: According to the findings of this study, it is estimated that longer EDTA attendance is an efficient agent in removing calcium and also adequate density of silica particles can be efficient in removal of PCR inhibitors.