مطالعه كاتپسين‌هاي مرتبط با هضم هموگلوبين و ويتلين در نوزاد كنه ري پي سفالوس (بوافيلوس) آنولاتوس‌ ‌به روش زايموگرافي يك بعدي و دوبعدي

Study of cathepsins involved in haemoglobin and vitellin digestion in Rhipicephalus (Boophilus) annulatus larvae by one- and two-dimensional zymography

زمينه مطالعه:‌ بيوشيمي هضم پروتيين‌ها در كنه‌ها يك فرآيند پيچيده است و مطالعات پروتيوميكس عملكردي كه بيانگر نقش آنزيم‌هاي پروتيوليتيك است مي‌تواند در ارتباط با انتخاب اين آنزيم‌ها بعنوان واكسن مفيد واقع شود. تبديل پروتيين‌هاي خون از جمله هموگلوبين به ويتلين در كنه‌هاي بالغ ماده صورت مي‌گيرد. همچنين هضم ويتلين در تخم و لارو كنه‌هاي خون نخورده در جهت تامين اسيد آمينه و انرژي، از فرآيندهاي مهم و حياتي در روند تكاملي كنه‌ها مي‌باشد. مطالعات متعدد، حاكي از وجود شبكه اي از آنزيم‌هاي پروتيوليتيك در رابطه با هضم هموگلوبين و ويتلين مي‌باشد. اين آنزيم‌ها در اغلب موارد مربوط به سيستيين پپتيدازها و آسپارتيك پپتيدازها مي‌باشند. هدف:‌ ‌هدف از اين مطالعه، بررسي كاتپسين‌ها در عصاره لارو كنه ري پي سفالوس ( بوافيلوس) آنولاتوس، بوده است. روش كار:‌ ‌در اين تحقيق، با اضافه نمودن هموگلوبين و ژلاتين به ژل آكريل آميد و با روش زايموگرافي يك بعدي و دو بعدي، به بررسي كاتپسين‌ها در عصاره لارو كنه ري پي سفالوس (بوافيلوس) آنولاتوس، پرداخته شد. نتايج :‌ ‌نتايج بدست آمده از زايموگرافي يك بعدي، نشان دهنده حضور يك باند حدود kDa 28 بود. در زايموگرافي دوبعدي نيز نواحي شفاف در زمينه تيره ژل با وزن‌هاي مولكولي حدود kDa 21 تا 65 و با pH ايزوالكتريك مختلف مربوط به كاتپسين‌ها، مشاهده شد. زماني كه DTT به بافر انكوباسيون (بافر استاتmM10 و 4 = ‌)pH اضافه گرديد، فعاليت پروتيازي افزايش يافت كه در زايموگرافي يك بعدي به صورت تشكيل باند شفاف واضح تر در مقايسه با نمونه‌هاي قرار گرفته در بافر فاقد DTT نمايان گرديد. نتيجه‌گيري‌نهايي: با توجه به اين كه pH بافر انكوباسيون اسيدي بوده و با اضافه نمودن DTT فعاليت اين آنزيم‌ها افزايش يافته است، لذا به‌نظر مي‌رسد كه برخي از اين آنزيم‌هاي پروتيوليتيك مربوط به سيستيين پروتيازها بوده‌اند

BACKGROUND: Enzymatic digestion of proteins in ticks is a complex process and the study of functional proteomics of these enzymes can help to select them as possible vaccine candidates. Blood protein changes (e.g. haemoglobin to vitellin) occur in female mature ticks. Vitellin digestion, as an amino acid and energy source, is one of the vital and important processes in development and evolution of tick eggs and larval stage of unengorged ticks. Several studies reveal a network of proteolytic enzymes involved in haemoglobin and vitellin digestion. These enzymes are mostly cysteine and aspartic peptidases. OBJECTIVES: The aim of this study was the detection of the cathepsins in Rhipicephalus (Boophilus) annulatus larvae extract. METHODS: In the current research, cysteine proteases extracted from Rhipicephalus (Boophilus) annulatus larvae were studied by one- and two-dimensional zymography. RESULTS: Findings from one dimensional zymography showed a transparent band with 28 KDa. In two-dimensional zymography transparent area are seen in the dark gel background distributed in 21 to 65 KDa zones related to cathepsins. When DTT was added to incubation buffer (10 mM acetate buffer, pH= 4), the proteolytic activity of some enzymes was increased and appeared as more clear transparent bands in one-dimentional zymography compared with samples incubated in buffer without DTT. CONCLUSIONS: As the pH of incubation buffer was acidic and adding DTT resulted in increased activity of the enzymes, therefore, some of these proteolytic enzymes are assumed to be cysteine proteases.