تعيين هويت انگل ليشمانيا با استفاده از روش‌هاي ميكروسكوپي و مولكولي و با هدف قرار دادن ژن ITS-rDNA در افراد مشكوك به ليشمانيوز در استان گلستان (89-1388)

Identification of Leishmania using microscopic and molecular methods in suspected patients of Cutaneous Leishmaniasis by targeting ITS-rDNA gene, Golestan province, Iran (2009-10)

زمينه و هدف : ليشمانيوز جلدي روستايي يك بيماري انگلي تك‌ياخته‌اي مشترك بين انسان و حيوان است كه به عنوان يك معضل بهداشتي در بسياري از كشورها و نيز ايران مطرح است. عامل بيماري ليشمانيا ميجر، ناقل اصلي آن فلبوتوموس پاپاتاسي و مهم‌ترين مخزن، رومبوميس اپيموس مي‌باشد. انسان مخزن اتفاقي ليشمانيوز جلدي روستايي است. اين مطالعه به منظور تعيين هويت انگل ليشمانيا با تشخيص ميكروسكوپي و مولكولي و هدف قرار دادن ژن ITS-rDNA در شرق استان گلستان انجام شد. روش بررسي : اين مطالعه توصيفي مقطعي روي 121 فرد مشكوك به بيماري ليشمانيوز جلدي روستايي در شهرستان‌هاي گنبد و مراوه‌تپه در شرق استان گلستان در سال‌هاي 89-1388 انجام شد. از ضايعات نمونه‌برداري مستقيم صورت گرفت و پس از رنگ‌آميزي با گيمسا مشاهده ميكروسكوپي به‌عمل آمد. از گسترش‌ها DNA استخراج و ژن ITS-rDNA با استفاده از PCR تكثير يافت. موارد مثبت ليشمانيا با استفاده از آنزيم BsuRI به روش RFLP تعيين گونه شد و با تعيين توالي و استفاده از نرم‌افزارهاي مولكولي گونه ليشمانيا تاييد شد. يافته‌ها : از كل 121 فرد مشكوك به بيماري ليشمانيوز جلدي روستايي، 113 نفر با مشاهدات ميكروسكوپي و 92 نفر با روش مولكولي به انگل ليشمانيا آلوده تشخيص داده شدند. موارد مثبت PCR با استفاده از روش RFLP تعيين گونه و 90 مورد ليشمانيا ميجر تشخيص داده شد. براي تاييد نهايي 8 مورد ليشمانيا ميجر تعيين توالي گرديد و مجدداً مورد تاييد قرار گرفت. در 2مورد از موارد مثبت كه توالي نامشخص بود؛ گونه ليشمانيا مشخص نشد. نتيجه‌گيري : با مقايسه نتايج تعيين توالي انگل ليشمانيا در اين مطالعه با موارد ثبت شده در بانك جهاني ژن، ليشمانيا ميجر به‌طور قطع در انسان در منطقه مورد تاييد قرار گرفت. با توجه به گزارش‌هاي مربوط به ديگر گونه‌هاي ليشمانيا در ناقلين و مخازن، اين گونه‌ها در اين مطالعه در انسان يافت نگرديد. هرچند دو مورد غير ليشمانيا ميجر مي‌تواند نشاني از آلودگي همزمان بيش از يك گونه ليشمانيا در انسان در منطقه باشد؛ اما با روش‌هاي به‌كار رفته در اين مطالعه آلودگي همزمان دو ليشمانيا در يك فرد قابل تفكيك نبود.

Background and Objective: Zoonotic Cutaneous Leishmaniasis (ZCL) is a parasitic disease which caused by a protozoan belongs to the genus Leishmania. ZCL is of great public health importance in many countries and also in endemic parts of Iran. Leishmania major is the causative agent, Phlebotomus papatasi as the main vector and Rhombomys opimus is the most important reservoir of the disease. Species identification of Leishmania in a large scale of human samples is necessary to conduct a useful program for controlling the disease outspread. This study was done to identify the Leishmania using microscopic and molecular methods in suspected patients of Cutaneous Leishmaniasis by targeting ITS-rDNA gene, Golestan province, Iran. Materials and Methods: 121 smears collected from suspected patients of ZCL, in Eastern region of Golestan province, Iran during 2009-10, stained and examined under a light microscope. DNA of parasites extracted directly from smears and ITS-rDNA gene amplified. Positive samples digested with BsuRI restriction enzyme, according to RFLP method and subsequently the parasite was identified. After sequencing the ITS-rDNA gene, Molecular software was applied for verification of RFLP results. The achieved results were definitely approved by this procedure. Results: 113 out of 121 and 92 out of 121 samples detected as Leishmania positive using microscopic examination and molecular method respectively. All 92 molecular positive samples digested with BsuRI endonuclease and 90 individuals identified as Leishmania major. In order to final verification, 8 samples of Leishmania major sequenced and confirmed by molecular software analysis. Unfortunately, sequences of two samples which were not Leishmania major were not readable, and consequently, these could not be identified. Conclusion: Comparison of obtained sequences of current study with Gene Bank sequences confirmed L.major in human from Northern Iran. Other species of Leishmania were not identified in this investigation but detection of two other samples, which were not L.major, could indicate the role of other Leishmania species causing infection in human in Eastern region of Golestan province, northern Iran. These findings should be considered to improve the disease control programs, which can be led to increase the rate of public health in Golestan province.