تهيه سازه اختصاصي بذر حاوي قطعات OMEGA و SAR به منظور افزايش بيان ژن در بذر گياه

Preparation of a Seed Specific Construct Containing Sequences OMEGA and SAR in Order to Increasing Gene Expression in Plant Seed

پايين بودن سطح بيان ژن ها، از مهم ترين فاكتورهاي محدودكننده توليد پروتيين هاي نوتركيب در گياهان مي باشد. انتخاب بافت مناسب گياه جهت بيان و نيز بهبود تظاهر قطعه ژني از جمله راه هاي افزايش بيان ژن در گياه مي باشند. در اين پژوهش با طراحي و تهيه سازه اختصاصــــي بذر به هــــمراه قطعـــات افزايـــنده بيــان ژن؛ OMEGA(Tobacco Mosaic Virus 5ʹ –leader) و SAR (Scaffold Attachment Region) سعي شده است تا ضمن بيان اختصاصي ژن موردنظر در بذر گياه، بيان آن نيز افزايش يابد. توالي OMEGA مورد استفاده، به عنوان يك تنظيم كننده ترجمه عمل مي كند و كارآيي ترجمه را بالا مي برد و توالي SAR با مكانيزم هاي مختلف مي تواند از خاموشي ژن منتقل شده جلوگيري كند. در ابتدا با طراحي آغازگرهاي اختصاصي و انجام واكنش PCR قطعه OMEGA به ابتداي ژن GUS متصل شد. قطعه ي SAR (pS206-1) نيز از ژنوم گياه توتون جداسازي گرديد. سپس دو قطعه با استفاده از روش SOEingPCR به هم متصل شدند به نحوي كه توالي OMEGA در بالادست ژن GUS و توالي SAR در پايين دست آن قرار گرفت. صحت قطعه حاصله (?-GUS-pS206-1) با استفاده از هضم آنزيمي و توالي يابي مورد تاييد قرار گرفت. سپس ساب-كلونينگ در ناقل گياهي pBI121 حاوي پيش برنده اختصاصي بذر انجام شد.

Low level expression of transgene is one of the most important factors limiting production of recombinant proteins in plants. Some ways that help to increasing gene expression are selecting of appropriate tissue and improving transgen expression. For this ,purpose, in this study we endeavorto obtain specifically gene expressionin plant seeds as well as improving desired gene expression by design and preparation of seed specific construct containing effective sequences in expression (OMEGA and SAR).Omega sequence acts as translation regulator and enhances the translation efficiency. It is believed that SAR fragment inhibits the silence of transgene by different mechanisms.In the first step, omega sequence joined to upstream of GUS gene by specific primers and PCR reaction. The SAR sequence (pS206-1), isolated from tobacco genome and then spliced to downstream of GUS gene by SOEingPCR reaction. The resulting fusion fragment with the expected size cloned in TA cloning vector. Cloning in TA vector was confirmed by colony-PCR, restriction enzyme digestion and sequencing. To obtain seed specific cassette we subcloned fusion fragment in plant expression vector pBI121 in which CaMV35s promoter has been replaced with seed specific promoter. Cloning was confirmed by colony-PCR and digestion.