بيان زير واحد S100A8 نوتركيب و اثر كلسيم بر ساختار سوم آن

Expression of recombinant S100A8 subunit and evaluation of Ca effect on its tertiary structure

زمينه: S100A8 به عنوان يكي از زير واحدهاي سازنده هترودايمر كالپروتكتين در بسياري از فرآيندهاي وابسته به التهاب و سرطان ايفاي نقش مي كند. هدف: مطالعه به منظور توليد S100A8 به صورت نوتركيب و تعيين اثر كلسيم بر ساختار سوم آن انجام شد. مواد و روش ها: اين مطالعه تجربي در سال 1392 در دانشگاه علوم پزشكي قزوين انجام شد. ابتدا زير واحد S100A8 در پلاسميد pET15b نوتركيب و ميزبان E. Coli BL21 (DE3) به صورت پروتيين داراي his-tag بيان شد. فرآيند تخليص پروتيين در دو حالت محلول و نامحلول، با استفاده از ستون نيكل و غلظت هاي مختلف ايميدازول انجام شد. بيان و خلوص پروتيين نوتركيب از طريق الكتروفورز SDS-PAGE ارزيابي شد. ساختار سوم S100A8 با استفاده از روش طيف سنجي فلورسانس، در حضور و عدم حضور كلسيم بررسي گرديد. يافته ها: در حالت نامحلول بيش ترين پروتيين S100A8 با وزن مولكولي 8 كيلودالتون بيان شد. در فرآيند تخليص، خالص ترين پروتيين محلول با استفاده از غلظت هاي 150 و 200 ميلي مولار ايميدازول به دست آمد. در طول موج 330 نانومتر، بيش ترين ميزان نشر فلورسانس S100A8 در حضور و عدم حضور كلسيم مشاهده شد و شدت نشر در حضور غلظت هاي مختلف كلسيم كاهش يافت. نتيجه گيري: تغيير ساختار سوم زيرواحد S100A8 در حضور كلسيم، ممكن است عملكرد پروتيين را تحت تاثير قرار داده و به درك نقش اين پروتيين در فرآيندهاي التهابي و سرطان كمك نمايد.

Background: S100A8 as a subunit of calprotectin heterodimer plays a role in inflammatory processes and cancer. Objective: The aim of this study was to express recombinant S100A8 and to evaluate Ca effect on its tertiary structure. Methods: This experimental study was performed in Qazvin University of medical sciences, 2013. Recombinant S100A8 subunit was expressed in pET15b, E. coli BL21 (DE3) system as a his-tagged protein. The protein purification process was accomplished under both native and denaturing conditions using Ni-NTA column and different concentrations of imidazole. The expression and homogeneity of recombinant protein was analyzed using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The tertiary structure of S100A8 was studied in the absence and presence of Ca using fluorescence spectrometry. Findings: The highest expression of S100A8 with apparent molecular weight of 8 kDa was found in denaturing conditions. In the purification process, the most purified S100A8 was seen with a gradient of 150 and 200 mM imidazole. The maximum fluorescence emission of S100A8 was observed at 330 nm in the presence and absence of calcium. Emission intensity was decreased in the presence of different concentrations of calcium. Conclusion: Changes in tertiary structure of S100A8 subunit in the presence of calcium may affect the protein function and may contribute to understand the role of this protein in cancer and inflammatory processes.