حذف ژن پروزامين سنتتاز در باكتري بروسلا ملي تنسيس Rev1 بمنظور توليد سويه ضعيف شده

Deletion of Perosamine Synthetase Gene in Brucella Melitensis Rev1 to Generate the Attenuated Mutant Strain

مقدمه: هدف از اين مطالعه، انجام حذف ژني در باكتري بروسلا ملي تنسيس Rev1 به منظور دستيابي به يك سويه تضعيف شده، بود. بدين منظور تلاش گرديد تا ژن كدكننده آنزيم پروزامين سنتتاز(per) ، يكي از ژن‏هاي درگير در تشكيل ساختار زنجيره O از LPS ديواره باكتري، از طريق انجام نوتركيبي همساخت حذف گردد. مواد و روش‏ها: نوتركيبي همساخت با استفاده از وكتور خودكشي حامل كاست حذف كه شامل ترادف نوكليوتيدي كدكننده مقاومت آنتي‏بيوتيكي كانامايسين (kanR) بهمراه ترادف‏هاي بالادست و پايين دست ژن per در طرفين آن بود، صورت گرفت. كاست حذف با انجام واكنشهاي PCR سه مرحله‏اي با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي ساخته شده و به منظور ساخت وكتور خودكشي، درون وكتور pBluescriptIISK(-) كلون گرديد. انتقال وكتور خودكشي بدرون باكتري با روش الكتروپوريشن صورت گرفت. يافته‏ها: نتايج حاصل، صحت ساخت كاست حذف و وكتور خودكشي را تاييد كرد. به دنبال انتخاب سويه جهش يافته، حذف ژن per با انجام واكنش‏هاي PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و تعيين توالي قطعه تكثير يافته، مورد تاييد قرار گرفت. همچنين با مقايسه محصول واكنشهاي RT-PCR انجام يافته با پرايمرهاي اختصاصي از سويه‏هاي والد و جهش يافته، عدم بيان آنزيم پروزامين سنتتاز مورد تاييد قرار گرفت. بحث و نتيجه‏گيري: سويه حاصل يك سويه جهش يافته داراي نقص در ساختار LPS خود بوده كه علاوه بر كاهش خطا در تمايز ما بين حيوان واكسينه شده و حيوان آلوده در تست‏هاي تشخيصي، مي‏تواند با انجام تست‏هاي ايمنولوژيكي بعنوان يك سويه كانديد واكسن مورد بررسي قرار بگيرد.

Background: The aim of this study was to employ gene knockout technique in Brucella melitensis Rev1 to attain the attenuated mutant strain. Therefore, we deleted the perosamine synthetase encoding gene (per), one of the LPS O-chain coding genes, by homologous recombination. Materials and Methods: Homologous recombination was performed using a suicide vector containing deletion cassette, which comprised kanamycin resistance sequence (kanR) flanking with the per upstream and downstream sequences. Deletion cassette was constructed by PCR reactions using specific primers, and cloned into pBluescriptIISK(-) to construct suicide vector. The suicide vector was transformed into Brucella by electroporation. Results: The results were confirmed deletion cassette and suicide vector construction. After mutant strain selection, deletion of the per gene was confirmed by PCR using specific primers, and sequencing. Also, loss of the per gene function was confirmed by comparison of RT-PCR products from wild type and mutant strain. Conclusion: The mutant Brucella had deficiency in its LPS O-chain structure, so in addition to reduce error in diagnostic tests to discriminate between vaccinated and infected animal, it can to characterize as a candidate vaccine with later immunological tests.