طراحي روشي نوين بر پايه پپتيد هاي تراوا كننده غشا جهت افزايش بازدهي انتقال DNA خارجي به باكتري اشرشياكولي

Designing Novel Method for Increasing the External DNA Transformation Efficiency into the Escherichia coli, based on a Membrane Permeable Peptide

سابقه و هدف: انتقال DNA خارجي با بازدهي بالا به داخل باكتري از مهمترين مراحل در زيست فناوري ميكروبي مي‌باشد. براي اين منظور چند روش مرسوم است كه در بين آن‌ها روش كلسيم كلرايد سرد از جمله مهمترين و ارزان‌ترين روش‌ها جهت انتقال DNA به درون سلول‌هاي باكتريايي گرم منفي مانند Escherichia coli مي‌باشد. به طور معمول بازدهي انتقال DNA در اين روش107- 105 كلوني براي يك ميكروگرم از DNA خارجي مي‌باشد. با توجه به اهميت فرايند انتقال DNA، تلاش‌هاي بسياري به منظور بهينه‌سازي روش‌هاي مرسوم همچون كلريد كلسيم صورت گرفته است. در اين مطالعه نشان داديم با استفاده از يك پپتيد كاتيونيك تراوا كننده غشا (CM11) و بر پايه روش استاندارد كلريد كلسيم، مي‌توان DNA خارجي را با بازدهي بالاتري به درون باكتري E.coli انتقال داد. مواد و روش ها: سلول‌هاي باكتريايي توسط غلظت‌هاي متفاوت پپتيد ( 5/0، 1 ،2 ،3 و 6 ميكرو‌گرم در ميلي‌ليتر) و به دو روش متفاوت و بر پايه مستعدسازي توسط كلريد كلسيم، تيمار شدند. سپس پلاسميدهايpET-28a(+), pGEX4T-1 وpUC19 به عنوان مدل و به صورت جداگانه به درون باكتري مستعد شده منتقل گرديدند. يافته ها: نتايج نشان داد كه بالاترين بازدهي انتقال پلاسميد براي باكتري‌هاي مستعد شده در حضور غلظت 1 ميكروگرم در ميلي‌ليتر پپتيد بدست مي‌آيد. در اين غلظت افزايش انتقال براي پلاسميدهايpET-28a(+), pGEX4T-1 وpUC19 به ترتيب 4/4، 7/4 و 4 برابر نمونه كنترل بود. نتيجه‌گيري: اين مطالعه نشان داد كه پپتيد CM11 به عنوان يك پپتيد تراوا كننده غشا سلول مي‌تواند باعث افزايش كارامدي انتقال DNA به درون باكتري E. coli با استفاده از مستعدسازي به روش شيميايي كلريد كلسيم گردد.

Aim and Background: High efficient transformation of external DNA into the bacterial cells accounts as the main step of microbial biotechnology. For this purpose, some conventional methods have been developed. Using cold CaCl2 is one of the most important and cheapest ways for DNA transformation into the gram negative bacteria such as Escherichia coli. Commonly used methods have a low transformation rate about 105 to 107 transformants per 1?g of DNA. Due to the importance of DNA transformation procedure, numerous attempts have been applied to optimize the conventional methods such as cold CaCl2. In this study we showed that it is possible to increase DNA transformation efficiency into the E. coli in standard CaCl2 method, using a membrane permeable cationic peptide (CM11). Material and methods: Based on ClCa2 competent cell preparation method, the bacterial cells were treated by different concentration of peptide (0.5, 1, 2, 3 and 6 ?g/ml) in two different ways. Thereafter pET-28a (+), pGEX4T-1 and pUC19 as model plasmids were separately transformed into the competent cells. Results: Results showed that the highest plasmid transformation efficiency obtained at the present of 1 ?g/ml of peptide. In this concentration, the transformation efficiency of pET-28a (+), pGEX4T-1 and pUC19 plasmids were respectively 4.4, 4.7 and 4 fold higher than control sample. Conclusions: The results of this study revealed that in the chemical cold CaCl2 strategy for DNA transformation, CM11 as a cell membrane permeable peptide can increase the efficiency of DNA transformation into E. coli.